Propostas para explicar a fisiopatogenia da doença de Chagas
Joseli Lannes-Vieira
Laboratório de Biologia das Interações, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: lannes@ioc.fiocruz.br
A doença de Chagas é uma importante doença parasitária causada pelo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, afetando 16-17 milhões de pessoas na América Latina, como revisto por Moncayo em 2003. A fase aguda da infecção chagásica pode ser assintomática ou caracterizar-se por parasitemia patente, podendo vir acompanhada de febre, mal-estar, linfadenopatia e por inflamação no sítio de infecção, como descrito inicialmente por Carlos Chagas em 1909. O coração é o órgão mais afetado na fase aguda e alguns indivíduos (3-10%) podem apresentar quadros graves e eventualmente fatais de miocardite. Apesar disso, na maioria dos casos manifestações clínicas não são encontradas na fase aguda. A maioria dos pacientes desenvolve a forma indeterminada da doença, não apresentando sinais clínicos. Contudo anos ou décadas após a infecção 10-30% dos pacientes apresentam uma das duas principais manifestações clínicas: (i) cardiopatia associada à miocardite e fibrose, resultando em insuficiência cardíaca, formação de trombos e acidentes cerebrovasculares; e (ii) alterações digestivas como megacólon e/ou megaesôfago, que podem estar associadas a distúrbios gastro-intestinais, como, por exemplo, regurgitação, má nutrição e constipação severa, como revisto por Rossi e Mengel e Higuchi e colaboradores.
O estabelecimento de resposta imune que resulta em processo inflamatório nos tecidos alvos durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi é essencial para o controle do parasitismo e equilíbrio da relação parasito/hospedeiro, o que é observado na maioria dos portadores da doença de Chagas. Entretanto, em cerca de 30% dos pacientes a inflamação torna-se progressiva, resultando nas disfunções cardíaca e/ou digestiva. A escassez de parasitos nos tecidos afetados e a aparente falta de correlação entre sua presença e a ocorrência de infiltrado inflamatório nestes tecidos originou algumas teorias como a parassimpaticopriva, apresentada por Köberle em 1958 e a de autoimunidade, recentemente revista por Leon e Engman e Cunha-Neto e colaboradores. No entanto, interpretações recentes dos resultados mostrando a existência de processos autoimunes na infecção pelo T. cruzi têm colocado em dúvida a relevância do reconhecimento autoimune na patogenia das manifestações crônicas da infecção chagásica, como revisto por Kierszenbaum. Também, o envolvimento de fenômenos trombo-embólicos na patogenia da cardiopatia chagásica crônica foi proposto por Rossi e colaboradores.
A detecção de material genético (por PCR) e antígenos (por imuno-histoquímica) do T. cruzi em associação com infiltrados inflamatórios sugere a participação direta do parasito na formação e perpetuação das lesões teciduais e perda de funcionalidade dos órgãos na doença de Chagas. Existem ainda evidências mais recentes de que a persistência do parasito nos tecidos associada a mecanismos homeostáticos mal-adaptados, como os processos oxitativos/anti-oxidativos e pró-inflamatórios/anti-inflamatórios associados à desregulação da resposta imune sejam críticos para a formação e a progressão da cardiopatia chagásica, como revisto por Higuchi e colaboradores e Lannes-Vieira.
Acredita-se hoje que as diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas sejam consequência de múltiplos fatores ligados ao T. cruzi, como (i) cepa, (ii) virulência, (iii) antigenicidade, (iv) tropismo e (v) tamanho do inóculo, e ao hospedeiro, tais como (i) idade, (ii) características relacionadas a hormonais sexuais, (iii) características genéticas e (iv) status imune prévio e decorrente de co-infecções. Assim, os mecanismos moleculares envolvidos na patogênese das manifestações crônicas na doença de Chagas que resultam na forma cardíaca, na forma digestiva com formação de megacólon e/ou megaesôfago, assim como da forma nervosa permanecem em discussão.
Forma cardíaca
Joseli Lannes-Vieira
Laboratório de Biologia das Interações, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: lannes@ioc.fiocruz.br
Desde a descoberta da tripanossomíase americana por Carlos Chagas, muitos esforços têm sido empregados na tentativa de compreender os intrigantes mecanismos patogênicos da cardiopatia chagásica crônica, a principal causa de morte e incapacidade nos indivíduos infectados pelo T. cruzi.
Aspectos históricos da descoberta da forma cardíaca da doença de Chagas podem ser encontrados na seção “A forma cardíaca da doença de Chagas – histórico”. A caracterização da patologia e das alterações clínicas da forma cardíaca da doença de Chagas pode ser encontrada na seção “A forma cardíaca da doença de Chagas – realidade atual e avaliação funcional”.
Em estudo recente Freitas e colaboradores demonstraram que a etiologia é o principal fator prognóstico para o risco de morte no caso das doenças cardíacas. Eles observaram que a doença de Chagas apresenta o maior risco de morte quando comparada à falha cardíaca de origem idiopática, isquêmica ou hipertensiva, condições que não apresentam o componente inflamatório crônico observado na infecção chagásica. Contudo, os fatores fisiopatológicos que controlam a formação e a perpetuação da inflamação cardíaca nos portadores da doença de Chagas permanecem a ser esclarecidos. A miocardite aguda da infecção chagásica é caracterizada pela (i) presença de intenso parasitismo, (ii) destruição das células musculares cardíacas parasitadas e (iii) presença de infiltrado inflamatório mononuclear, sendo atribuída diretamente ao parasito e à resposta imune humoral e/ou celular dirigida aos seus antígenos. Por outro lado, a miocardite crônica da infecção chagásica é distingui-se por apresentar (i) infiltrado inflamatório polifocal com células mononucleares, (ii) destruição de fibras miocárdicas no foco inflamatório, (iii) áreas de fibrose e (iv) raro encontro de parasitos, não havendo correlação entre parasitismo e reação inflamatória, como inicialmente descrito por Vianna em 1911 e Chagas em 1916 (Figura 1).
Figura 1 – Secções de coração de camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi, mostrando o aspecto do coração de animal não infectado, em fase aguda e em fase crônica de infecção. Notar a associação do infiltrado inflamatório ao ninho de formas amastigotas do parasito (área pontilhada e seta), enquanto na fase crônica esta associação é mais rara e, na maioria dos infiltrados inflamatórios, ausente; coloração: hematoxilina e eosina; 200X. Modelo experimental que produz aspectos da fase aguda e crônica da doença de Chagas, segundo dos Santos et al., 2001. Autores: Paula Vitória Alves dos Santos e Joseli Lannes, IOC, Fiocruz. hematoxilina e eosina; 200X. Modelo experimental que produz aspectos da fase aguda e crônica da doença de Chagas, segundo dos Santos et al., 2001. Autores: Paula Vitória Alves dos Santos e Joseli Lannes, IOC, Fiocruz.
Assim, diversas teorias surgiram na tentativa de explicar a patogenia da cardiopatia associada à doença de Chagas. Abaixo estão revistos alguns aspectos históricos a atuais destas tentativas de explicar a patogenia da disfunção cardíaca chagásica crônica. Deve ser considerado que ainda que existam dados e argumentos que suportem estas teorias, elas não são mutuamente excludentes e os mecanismos imunopatogênicos que as sustentam poderiam contribuir coletivamente para o quadro final da cardiopatia. Também estão revisados os principais atores do processo inflamatório cardíaco, como componentes celulares e moleculares, com as citocinas, e os processos fisiopatológicos, como fibrose e apoptose, propostos participarem da patogenia da cardiopatia chagásica. Por último, são revistos os estudos de polimorfismo gênico que tentam associar características do hospedeiro à suscetibilidade, progressão e risco de morte na cardiopatia chagásica crônica.
Teorias propostas e possíveis mecanismos patogênicos da cardiopatia chagásica crônica
Teoria parassimpaticopriva ou acometimento do sistema nervoso autônomo
O acometimento do sistema nervoso autônomo na doença de Chagas foi inicialmente proposto por Carlos Chagas, em 1913. Contudo, a primeira descrição de lesões em gânglios e fibras nervosas autonômicas cardíacas foi feita por Möckenberg, em 1924, utilizando o modelo de infecção experimental em cães. Mas foi Köberle que realizou estudos anatomo-patológicos em portadores da doença de Chagas nas décadas de 1950 e 1960 que demonstraram a existência de comprometimento importante do sistema nervoso autônomo na doença de Chagas, em especial do parassimpático. Estes estudos e os aspectos atuais da pesquisa nesta área foram revistos por Rocha e colaboradores na seção Provas Autonômicas no capítulo Métodos de avaliação funcional não-invasivos da cardiopatia chagásica.
Teoria da autoimunidade
A hipótese da participação central do reconhecimento autoimune na patogênese da cardiopatia chagásica surgida nos anos 1970 teve impacto negativo por mais de 20 anos na pesquisa de novas drogas tripanocidas ou vacinas para doença de Chagas. O desenvolvimento destas passou a ser considerado perda de tempo uma vez que os processos autoimunes seriam deflagrados por antígenos do T. cruzi logo no início da infecção. Neste sentido, componentes vacinais poderiam contribuir para o agravamento da infecção que seriam supostos prevenir, como criticamente revisto por Kierszenbaum em 2005. Mas como isto começou e o que de fato demonstra e sustenta a existência de processos auto-reativos e autoimunidade na infecção chagásica? Que papel teriam os processos autoimunes na patogenia da doença de Chagas?
Margarinos-Torres em 1929 e Chagas em 1934 propuseram que as lesões inflamatórias intensas associadas à ausência de parasitos na fase crônica da infecção chagásica teriam como origem “mecanismos imuno-alérgicos” ativados por produtos liberados pelo parasito degenerado. Posteriormente, Kozma e colaboradores em 1960 propuseram que durante a fase aguda da infecção fibras miocárdicas intensamente parasitadas se romperiam, liberando antígenos próprios intra-citoplasmáticos, naturalmente não acessíveis ao sistema imune, que desencadeariam uma cascata de reações autoimunes com a produção de anticorpos anti-miocárdio.
Evidências experimentais para a participação de processos autoimunes na gênese dos processos inflamatórios encontrados no miocárdio de portadores da doença de Chagas surgiram com a demonstração de resposta imune mediada por células tanto contra antígenos do parasito, quanto contra antígenos próprios em animais imunizados com antígenos do T. cruzi. Também, foi mostrado que pacientes e coelhos infectados apresentavam linfotoxicidade contra fibras cardíacas parasitadas ou não, por reconhecimento e destruição direta das fibras cardíacas mediada por células T ativadas, como mostrado por Santos-Buch e Teixeira, ou por citotoxicidade celular dependente de anticorpo, como mostrado por Laguens e colaboradores. Assim, os autores propuseram que mecanismos autoimunes seriam estabelecidos logo após a infecção e seriam perpetuados pela contínua estimulação antigênica durante a infecção. Apesar do impacto que estes achados causaram nos estudos sobre a patogenia da miocardite chagásica, outros autores como Mortatti e colaboradores não conseguiram demonstrar aumento do reconhecimento de fibras cardíacas autólogas, na presença ou não de anticorpos anti-T. cruzi. Contudo, a participação de mecanismos autoimunes na gênese da miocardite chagásica crônica encontrou suporte em trabalhos mostrando a presença de anticorpos (do tipo EVI), presentes em soro de portadores da doença de Chagas, que reconhecem células endoteliais e membranas plasmáticas de fibras musculares cardíacas e esqueléticas, como publicado por Cossio e colaboradores. Também suportaram esta hipótese a demonstração da presença de anticorpos em pacientes e animais de experimentação infectados pelo T. cruzi que reconhecem (a) neurônio/glia por Ribeiro dos Santos, (b) nervo periférico por Khoury e colaboradores, (c) proteína básica da mielina por Chaves e colaboradores e Al-Sabbagh e colaboradores, (d) linfócitos por Ribeiro dos Santos e Buch, (e) timócitos e componentes do microambiente tímico por Savino e colaboradores. Entretanto, muitos destes trabalhos devem ser considerados cuidadosamente, pois os anticorpos do tipo EVI reconhecem o epítopo Gala1-3Gal da molécula de laminina de roedores, uma glicoproteína de matriz extracelular, compartilhada por um epítopo presente em uma glicoproteína do T. cruzi, como demonstrado por Szarfman e colaboradores, Gazzinelli e colaboradores e Umezawa e Kanbara. Por outro lado, em muitos trabalhos nos quais supostamente se demonstra a reatividade de anticorpos de soro de pacientes contra antígenos próprios, os ensaios foram realizados tendo como substrato antígenos e tecidos de ratos, coelhos, camundongos e outros animais, refletindo, assim, respostas alo-reativas e não auto-reativas.
Ainda, tentando explicar o envolvimento de processos autoimunes na gênese da miocardite chagásica, Ribeiro dos Santos e Buch propuseram que nos primeiros dias após a infecção, antígenos das formas amastigotas seriam liberados nas proximidades de fibras cardíacas ou neurônios, de modo que estas células seriam sensibilizadas por estes antígenos. Assim, o aparecimento de resposta imune humoral e/ou celular contra o parasito determinaria a destruição das células sensibilizadas pelos antígenos parasitários. Por ocasião da destruição das células normais sensibilizadas ocorreria a liberação de auto-antígenos (ou antígenos crípticos) e, consequentemente, reação autoimune. Tal reação dependeria de uma predisposição genética do indivíduo ou animal de experimentação e seria responsável pelo agravamento ou destruição tecidual contínua. Experimentos trouxeram suporte a esta possibilidade ao mostrarem que fibras musculares e neurônios são passíveis de sensibilização in vitro por antígenos liberados por células infectadas ou por frações microssomais do T. cruzi, sendo estas células lisadas por linfócitos ou granulócitos dos tipos eosinófilos e neutrófilos na dependência de anticorpos que reconhecem antígenos parasitários e complemento, como mostrado por López e colaboradores.
Por outro lado, Hudson em 1985 propôs que reação cruzada entre epítopos antigênicos do parasito e células cardíacas poderia ser a responsável pela ativação de linfócitos T auto-reativos na infecção chagásica. Os clones auto-reativos seriam perpetuados após sofrerem ativação policlonal durante a fase aguda da infecção, sendo este, segundo Petry e Eisen, o mecanismo mais provável para o desenvolvimento dos processos autoimunes na doença de Chagas. Em suporte a esta hipótese encontra-se a demonstração da existência de reatividade cruzada entre proteínas ribossomais e antígenos do parasito, descrito por Levin e Bonfa e colaboradores e de mimetismo molecular entre um antígeno de 160 kD, associado ao flagelo do T. cruzi, e uma proteína de 48 kD do sistema nervoso do hospedeiro, descrito por Van Voorhis e colaboradores.
Mais recentemente, foi identificado um epítopo de 6 ácidos aminados da cadeia pesada da molécula de miosina que apresenta homologia com um antígeno imuno-dominante do T. cruzi (a proteína B13). Além disso, Cunha-Neto e colaboradores demonstraram que 100 % dos soros de portadores da doença de Chagas crônicos cardiopatas apresentam anticorpos que reagem com miosina cardíaca e B13, enquanto que somente 14% dos assintomáticos apresentam essa reatividade cruzada. Além disso, os autores mostraram que linhagens de células T CD4+ obtidas de fragmentos cardíacos de portadores da doença de Chagas crônicos cardiopatas respondem ao estímulo proliferativo in vitro a ambas proteínas. Contudo, não foi esclarecido se a resposta cruzada é resultado do reconhecimento de ambas as proteínas por um único clone ou a existência de vários clones com especificidades antigênicas diferentes nas linhagens de células T. De qualquer modo, miosina é um antígeno intracelular e a participação do reconhecimento deste antígeno por anticorpos ou células na patogênese da cardiopatia não foi demonstrada, podendo ser este auto-reconhecimento um importante mecanismo fisiológico de remoção de material celular após a lise induzida pelo parasito.
Outra evidência que deu suporte à existência de processos autoimunes na fase crônica da infecção chagásica surgiu dos experimentos realizados por Laguens e colaboradores e Said e colaboradores que transferiram células T, sem parasitos, de animais cronicamente infectados para camundongos normais, levando à geração de lesões inflamatórias no coração e tecido nervoso central e periférico, mimetizando lesões crônicas. Hontobeyrie-Joskowicz e colaboradores mostraram que linfócitos T CD4+ apresentavam resposta imune do tipo hipersensibilidade tardia contra o T. cruzi e antígenos irrelevantes (hemácias de carneiro, por exemplo), respondendo de modo cruzado a antígenos do parasito e nervo periférico. Entretanto, experimentos posteriores não confirmaram tais resultados, sugerindo que linfócitos T auto-reativos contra componentes cardíacos surgem durante a infecção crônica como resultado do dano tecidual, como proposto por Gatass e colaboradores.
A evidência mais convincente dando suporte à participação da autoimunidade no desenvolvimento da miocardite chagásica foi trazida por Ribeiro dos Santos e colaboradores que mostraram a rejeição de corações neonatos transplantados na orelha de camundongos cronicamente infectados pelo T. cruzi com cinética similar à apresentada por alo-enxertos, sendo esta rejeição mediada por células CD4+. Contudo, Tarleton e colaboradores, utilizando o mesmo modelo, não conseguiram reproduzir os achados de Ribeiro dos Santos e mostraram que a presença do parasito no tecido cardíaco é “necessária e suficiente” para que ocorra a rejeição do miocárdio transplantado. Evidências experimentais anteriores já apontavam nesta direção, como revisto abaixo.
Neste momento, deve ser considerado que a presença de auto-anticorpos e células T auto-reativas tem sido demonstrada em indivíduos normais em baixa frequência desde os anos 50, estando a frequência destas células associadas a processos de injúria tecidual, como por exemplo, infarto do miocárdio. Acredita-se que a presença destes anticorpos células esteja associada a um mecanismo fisiológico de remoção de restos celulares, evitando a propagação da injúria tissular, ou mesmo a um mecanismo homeostático de controle de células tumorais por indução de apoptose, que estariam desregulados em indivíduos que apresentam doenças autoimunes, como revisto por Schwartz e Kipnis e Toubi e Shoenfeld. Como estas novas visões do reconhecimento autoimune se aplicam no entendimento da patogenia da doença de Chagas permanece a ser explorado.
De qualquer modo, como criticamente revisto por Kierszenbaum, a controvérsia apaixonada ao redor da hipótese de envolvimento de reconhecimento autoimune na patogenia da doença de Chagas teve como consequência o desencorajamento para o desenvolvimento de novos quimioterápicos e vacina contra o T. cruzi.
Ativação policlonal
A ativação policlonal de linfócitos B e T, observada na fase aguda da infecção chagásica, também é considerada como um fator desencadeador da patologia encontrada na fase crônica da infecção chagásica, como proposto por D’Imperio-Lima e colaboradores e Minoprio e colaboradores. Os autores propõem que a atividade proliferativa de células T e a intensa ativação policlonal de células B durante a fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi leva à produção de anticorpos de classe IgM e IgG com reatividade e, mesmo, multi-reatividade, contra miosina, mioglobulina, queratina e outras proteínas próprias. Assim, tal expansão policlonal poderia resultar da ativação de clones celulares reativos a uma grande variedade de antígenos do parasito ou a moléculas de natureza superantigênica provenientes do parasito, como proposto por Minoprio e colaboradores e Leite-de Moraes e colaboradores. Este processo poderia desempenhar um papel na perda de tolerância que precederia a resposta autoimune na doença de Chagas crônica.
Dando suporte a esta proposta, utilizando células do sangue periférico humano normal para infecção pelo T. cruzi in vitro com a cepa CL, Van Voorhis observou ativação de linfócitos, monócitos e produção de citocinas, sugerindo que a infecção pelo parasito dispara no hospedeiro uma resposta policlonal que pode ser responsável pela patologia observada na fase crônica. Segundo este e outros autores, como Coutinho, a infecção pelo T. cruzi poderia perturbar a regulação da resposta imune durante a fase aguda, podendo gerar um desequilíbrio da rede idiotípica de auto-anticorpos e células T auto-reativas naturais, contribuindo para a perpetuação das lesões na fase crônica da infecção chagásica.
Recentemente, o grupo de pesquisa liderado por Minoprio mostrou que prolina racemase, uma enzima que participa da diferenciação em formas infectantes do T. cruzi e sua penetração nas células do hospedeiro, quando secretada ativa células B do hospedeiro de forma policlonal e previne a resposta imune humoral específica, favorecendo a evasão do parasito e sua persistência no hospedeiro. Assim, a identificação de moléculas e a compreensão dos mecanismos que levam à ativação policlonal durante a infecção pelo T. cruzi podem contribuir para o desenvolvimento de vacinas, assim como para a identificação de alvos terapêuticos e o desenho racional de drogas tripanocidas ou imuno-moduladoras.
Presença de alterações microvasculares
Na infecção chagásica humana e no modelo de infecção murina é possível que alterações microvasculares que resultem de processos trombo-embólicos desempenhem papel relevante na gênese da cardiopatia crônica. A microangiopatia caracterizada por agregação plaquetária e trombose oclusiva presentes em pequenos vasos sanguíneos do epicárdio e do miocárdio podem causar mionecrose e degeneração focal com infiltrados inflamatórios, podendo contribuir para o desenvolvimento de aneurisma apical e da cardiomiopatia, como proposto por Rossi e colaboradores. Tanowitz e colaboradores mostraram que as alterações microvasculares são caracterizadas por microtrombos e disfunção das células endoteliais, que estão associadas à fibrose e a miocitólise cardíaca. Assim, como revisto por Higuchi e colaboradores, as alterações microvasculares poderiam ser consequência da ação de substâncias vasodilatadoras como resultado do processo inflamatório ou da presença do parasito, levando a processos isquêmicos que contribuiriam para as alterações elétricas características da cardiopatia chagásica.
Persistência do parasito e desregulação da resposta imune
A hipótese de que o parasito fosse o responsável direto pelas lesões ocorridas durante a fase crônica da infecção chagásica foi deixada de lado durante anos devido à hipótese de que mecanismos autoimunes seriam os principais responsáveis pela miocardite chagásica crônica, como revisto acima. No entanto, no início dos anos 90 estudos, como o de Jones e colaboradores e Higuchi e colaboradores, já demonstravam correlação entre a persistência de DNA do parasito (PCR) ou de seus antígenos (imuno-histoquímica) e a presença de células T CD8+ no infiltrado inflamatório no tecido cardíaco de portadores da doença de Chagas crônicos, sugerindo a participação direta do parasito no desenvolvimento da miocardite e gravidade da cardiopatia. Resultados semelhantes foram anteriormente descritos em modelos experimentais por Younès-Chennoufi e colaboradores. Estes dados fortemente indicaram que a miocardite chagásica crônica seria resultado da reatividade imunológica ao parasito e aos seus antígenos. Tarleton e Zhang, utilizando modelos murinos de transplante cardíaco na orelha de animais infectados, semelhantes aos descritos por Ribeiro dos Santos e colaboradores, mostraram que a persistência do parasito no tecido muscular é necessária e suficiente para manutenção da miocardite chagásica crônica, sendo este um dos fatores que determinariam a gravidade da doença de Chagas (Figura 2).
Figura 2 – Persistência do parasito na fase crônica da infeção pelo Trypanosoma cruzi é associada a presença de células TCD8+. (A) Secção de coração de camundongo infectado pelo T. cruzi mostrando diversas formas amastigotas e antígenos do parasito – vermelho, seta – associadas à inflamação mononuclear; imuno-histoquímica; 400X; (B) predominância de células TCD8+ no tecido cardíaco de camundongo cronicamente infectado pelo T. cruzi (dia 150 pós-infecção, cepa Colombiana); perfil de citometria de fluxo, segundo dos Santos et al., 2001. Autores: Paula Vitória Alves dos Santos e Joseli Lannes, IOC, Fiocruz.
Estudo recente de Fuenmayor e colaboradores com fragmentos endomiocardiais obtidos de pacientes com miocardite chagásica aguda mostrou que 58% das biópsias possuíam antígenos do T. cruzi detectáveis através de imuno-histoquímica, não estando a presença do parasito diretamente relacionada à presença de lesão inflamatória no tecido cardíaco, reabrindo a discussão sobre a participação direta do parasito nos processos inflamatórios.
Em 2003, Higuchi e colaboradores sugeriram que dependendo da resposta imune específica para antígenos do parasito desenvolvida na fase aguda da infecção chagásica, o indivíduo pode apresentar a forma crônica indeterminada ou evoluir para formas crônicas graves. Assim, uma resposta imune eficiente e regulada contra o parasito controlaria os níveis de parasitemia e limitaria os danos teciduais, este seria o caso dos pacientes que apresentam a forma indeterminada. Por outro lado, uma resposta ineficiente no controle do parasito, hiper-responsiva ou desregulada promoveria uma reação inflamatória persistente, resultando em doença mais grave como observado nos pacientes, por exemplo, com cardiomiopatia crônica, associada à miocardite com fibrose, alterações de matriz extracelular e de micro-circulação, originando arritmias ou morte súbita e também levando à dilatação ventricular e insuficiência cardíaca. Assim, os autores propõem que a interação parasito/hospedeiro durante a fase aguda seria essencial para determinar o curso evolutivo da fase crônica da doença de Chagas.
Recentemente, foi proposto por Perez-Fuentes e colaboradores e Lannes-Vieira que o desequilíbrio entre mecanismos oxidantes/anti-oxidantes (como óxido nítrico e a enzima superóxido dismutase) e citocinas pró/anti-inflamatórias (como TNF e IL-10), assim como a persistência de determinadas sub-populações de células T CD8+ no tecido cardíaco, poderiam influenciar a gravidade das lesões desenvolvidas pelo indivíduo infectado, que seriam consequência de uma relação duradoura e complexa entre o parasito e a resposta imune mal regulada dos indivíduos infectados que desenvolvem as formas graves da doença de Chagas.
Principais atores do processo inflamatório associado à cardiopatia chagásica
Populações celulares
A natureza das células presentes nos infiltrados inflamatórios encontrados no tecido cardíaco dos portadores da doença de Chagas e, consequentemente, a função biológica destas ainda é uma questão em aberto. Estudos histológicos desenvolvidos em material proveniente de necrópsias realizados por Vianna e, mais tarde, por Köberle, mostraram a presença de células mononucleares e de polimorfonucleares, principalmente neutrófilos e eosinófilos no tecido cardíaco de portadores da doença de Chagas crônicos. Com relação aos eosinófilos, Molina e Kierszenbaum observaram correlação direta entre o número destas células e a intensidade de lesões, sugerindo que elas estariam desempenhando papel importante no desenvolvimento de lesões cardíacas em pacientes com infecção chagásica. Contudo, nas últimas décadas o papel e a contribuição diferencial destas células não foram demonstrados.
A retomada do interesse nas células compondo a miocardite chagásica ocorreu no início dos anos 90. Reis e colaboradores e Higuchi e colaboradores mostraram que em pacientes cardiopatas crônicos, a miocardite é formada principalmente pelas células T CD8+, seguido das CD4+, embora macrófagos, linfócitos B, células NK e polimorfonucleares também possam estar presentes em menor número. D’Avila Reis e colaboradores mostrara quem as células T CD8+ expressam CD3, granzima A, mas não expressam CD57, sugerindo que estas sejam células T citolíticas e não células NK (natural killer). Reis e colaboradores e Benvenuti e colaboradores mostraram ainda a presença de células semelhantes a macrófagos ativados secretando TNF (tumor necrosis factor, fator de necrose tumoral) e poucas células B e NK associadas à lesão cardíaca. Havia ainda um aumento na expressão de moléculas de MHC (major histocompatibility complex, complexo principal de histocompatibilidade) de classe I em células miocárdicas de portadores da doença de Chagas com miocardiopatia crônica. Tostes Junior e colaboradores demonstraram que o contato de células CD8+ com células miocárdicas em destruição, em biópsias de portadores da doença de Chagas crônicos, constitui evidência de que a lesão de miocardiócitos seja mediada por linfócitos T citotóxicos. Neste sentido, Higuchi e colaboradores mostraram em lesões de miocárdio de portadores da doença de Chagas crônicos a presença de células CD8+ ao redor de áreas contendo antígenos do T. cruzi, enquanto as células CD4+ estavam mais dispersas pelo tecido. Estudo recente realizado por Fuenmayor e colaboradores mostrou não haver diferenças significativas entre as sub-populações CD4+ e CD8+ na miocardite aguda em portadores da doença de Chagas.
Estudos realizados por Tarleton e colaboradores e Rottenberg e colaboradores em modelos de infecção chagásica experimental têm mostrado a participação não somente das células T CD8+, mas também das células T CD4+ e das células B, no aumento da sobrevida assim como no controle do parasitismo. As células T CD4+ direcionam e potencializam mecanismos efetores, incluindo a mudança de isotipos de anticorpo e ativação de fagócitos e células T CD8+. Estas últimas são capazes de reconhecer as células infectadas e destruí-las, constituindo-se um importante mecanismo efetor no controle do parasitismo. Cunha-Netto e colaboradores estudando células isoladas de biópsias cardíacas propõem que na fase crônica da doença de Chagas, as células CD4+ respondam de forma deletéria contra antígenos próprios, desencadeando reações inflamatórias de cunho autoimune, sendo estas responsáveis pela manutenção da intensa miocardite crônica.
As células T CD8+ são ativadas principalmente através de moléculas de MHC I e co-receptores expressos por células apresentadoras de antígeno contendo restos de T. cruzi. A escassa resposta de células T CD4+ na presença de antígenos de T. cruzi sugere que a apresentação destes antígenos através de moléculas de MCH de classe II esteja inibida, como proposto por Tostes e colaboradores e Reis e colaboradores. Contudo, evidências experimentais trazidas por Lopes e colaboradores sugerem que a depleção de linfócitos T CD4+ na fase crônica da doença de Chagas esteja correlacionada com a morte celular programada por apoptose. A integridade celular do hospedeiro pode representar um valioso pré-requisito para a sobrevivência e desenvolvimento deste patógeno. A modulação induzida por patógenos da morte celular programada no hospedeiro pode resultar na eliminação de células imunes chave ou evasão do parasito das defesas do hospedeiro, que poderiam atuar limitando a infecção.
Com relação ao papel funcional das sub-populações de células CD4+ e CD8+, estudos realizados por Russo e colaboradores com depleção destas populações em C3H/HeJ infectados com a cepa CL mostraram que a depleção de células CD4+ induz aumento do parasitismo no coração e fígado. Por outro lado, quando o tratamento com anticorpos monoclonais anti-CD8 foi realizado, não foi observado aumento de parasitismo no tecido cardíaco, mas marcante aumento do parasitismo no fígado, sugerindo que a atividade das células T contra o T. cruzi varia de acordo com o tecido alvo da infecção. Tarleton e colaboradores mostraram que camundongos depletados de células CD4+ ou CD8+ apresentam maior parasitismo e associado à discreta diminuição da inflamação no tecido cardíaco na fase aguda exacerbação na fase crônica da infecção. Taleton e colaboradores também mostraram que animais deficientes em b2-microglobulina (b2–/–) ao serem infectados com o T. cruzi apresentam aumento da parasitemia e de mortalidade na fase aguda da infecção com marcante diminuição da inflamação no tecido muscular esquelético e cardíaco, quando comparados com os animais b2+/+ ou b2+/–. Estes experimentos sugerem que as populações de células T CD4+ e CD8+ além de necessárias para uma resposta imune eficaz, contribuem para o estabelecimento da miocardite.
Os linfócitos T CD8 citotóxicos (CTLs), assim como as células NK, participam da imunidade adaptativa e inata, respectivamente, e utilizam mecanismos similares para a destruição de seus “alvos”, embora exista o envolvimento de receptores distintos e da regulação da expressão de moléculas citolíticas, que é constitutiva nas células NK, mas regulada nas CTLs. As CTLs e as NK podem atuar tanto pela liberação por exocitose de constituintes dos grânulos citolíticos, como a perforina e as granzimas, como pelo engajamento de receptores de superfície celular, tais como os membros da família dos receptores de TNF (TNFR), incluindo o CD95 (ou Fas), como revisto por Lieberman. Outra função crucial das células T CD8+ é a produção de IFNg (interferon gamma, interferon gama), citocina essencial para a atividade protetora destas células, como revisto por Martin e Tarleton. Contudo, recentemente Leavey e Tarleton mostraram que as células T CD8+ presentes no tecido cardíaco de animais cronicamente infectados apresentam fenótipo ativado/memória com perfil CD62L-/lowCD44high, mas têm atenuada função efetora, caracterizada pela baixa produção de IFN, quando comparadas às células CD8+ do baço, sugerindo a existência de um mecanismo pelo qual o T. cruzi persista e gere dano tecidual. Assim, permanecem a serem esclarecidos os mecanismos moleculares que determinam a prevalência da população T CD8+ no tecido cardíaco dos portadores da doença de Chagas crônicos. Também, não está claro qual a dinâmica de ativação/migração das sub-populações de células T, assim como o papel desempenhado por elas na produção de mediadores pró- ou anti-inflamatórios na formação e perpetuação da miocardite chagásica crônica.
Muito resta ainda a ser esclarecido quanto aos papéis de diferentes populações celulares, como polimorfonucleares, mastócitos, células dendríticas, células T reguladoras e, mesmo, das sub-populações de macrófagos e de células T, na infecção pelo T. cruzi a nível sistêmico e nos tecidos alvos da infecção, principalmente, nos que sofrem alterações funcionais importantes para o paciente chagásico, como o tecido cardíaco.
Citocinas
Dados obtidos de modelos experimentais têm demonstrado que células inflamatórias, como macrófagos e células T, e as citocinas por elas produzidas desempenham papéis importantes na resposta protetora e na imunopatogenia em infecções parasitárias. Neste contexto, diversos estudos vêm mostrando que as citocinas, assim como outros mediadores da inflamação (prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, fator de agregação plaquetária, etc), desempenhariam papel importante na regulação da resposta imune durante a infecção pelo T. cruzi, estando envolvidas tanto na resistência à infecção, quanto nos mecanismos relacionados à evolução da doença de Chagas.
Na fase aguda da infecção pelo T. cruzi é observado o fenômeno de imunossupressão, caracterizado pela ausência de resposta proliferativa a antígenos do parasito e a outros antígenos não-relacionados ao T. cruzi. Esta imunossupressão é atribuída à diminuição da produção de IL-2 e da expressão do seu receptor (IL-2R), assim como ao aumento da atividade supressora de células T e macrófagos do baço, como descrito por Beltz e colaboradores e Tarleton. Neste sentido, Mosca e colaboradores mostraram que antígenos do T. cruzi induzem inibição parcial da resposta proliferativa das células mononucleares de sangue periférico de portadores da doença de Chagas, mostrando ser este um processo ativamente induzido pelo parasito.
O estudo em modelos experimentais em muito tem contribuído para o entendimento do papel funcional de citocinas na infecção pelo T. cruzi. Tarleton e colaboradores demonstraram que TNF, TGF-b (transforming growth fator, fator transformante de crescimento), IL (interleucina)-1 e IL-6 estão presentes no tecido cardíaco de animais cronicamente infectados. Powell e colaboradores demonstraram que os níveis de mRNA no miocárdio de duas linhagens de camundongos com perfis de resistência e suscetibilidade não se dicotomizam em tipos 1 e 2 de citocinas, como inicialmente esperado. IFNg, IL-10 e IL-13 têm níveis idênticos nas duas linhagens, enquanto que a diferença surge para IL-4, IL-6 e IL-12, que apresentaram níveis elevados nos camundongos suscetíveis. Talvani e colaboradores e dos Santos e colaboradores mostraram que durante a infecção aguda de camundongos C57BL/6 e C3H/He com a cepa Colombiana do T. cruzi existe a predominância de expressão de mRNA para citocinas do tipo 1, sobretudo IFNg e IL-12, assim como de TNF. Por outro lado, IL-4 e IL-10 apresentaram aumento da expressão no tecido cardíaco durante a fase crônica da infecção, sugerindo papéis reguladores para estas citocinas na imunidade mediada por células na infecção experimental pelo T. cruzi.
Estudos em modelos experimentais também têm demonstrado associação entre a produção de IFNg e de TNF e a resistência do hospedeiro à infecção pelo T. cruzi. Acredita-se que o IFNg associado ao TNF ative macrófagos, induzindo a produção de iNOS (inducible nitric oxide synthase, óxido nítrico sintase induzida), aumentando a produção de NO (nitric oxide, óxido nítrico) que, por sua vez, inibe a replicação intracelular do parasito, com descrito por Gazzinelli e colaboradores, Reed e Silva e colaboradores. Por outro lado, a IL-10 e TGF-b inibem a ativação de macrófagos induzida por IFNg, inibindo tanto a liberação de NO quanto a diferenciação de células produtoras de IFNg, como mostrado por Silva e colaboradores e Abrahamsohn e Coffman. De modo interessante, foi mostrado por Hunter e colaboradores que a administração de IL-12 a camundongos infectados pelo T. cruzi induz aumento dos níveis séricos de IFNg e TNF com redução da parasitemia e aumento nas taxas de sobrevivência dos animais, mas com aumento do número de células inflamatórias associadas aos ninhos de parasitos no tecido cardíaco. Ainda neste sentido, Michailowsky e colaboradores mostraram que a administração de IL-12 associada a benzonidazol a animais infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi, considerada resistente a drogas, aumenta o efeito inibidor da droga sobre o parasito, diminuindo a parasitemia e levando à negativação do PCR para DNA do T. cruzi no sangue e no tecido cardíaco. Contudo a maioria dos animais que receberam IL-12 morre com intensa miocardite, sugerindo as citocinas IFNg e TNF, induzidas por IL-12, têm papel crucial na formação da inflamação cardíaca.
A participação de TNF na fisiopatologia da infecção pelo T. cruzi ainda não está resolvida. A produção de TNF pode ser induzida diretamente pelo parasito ou por seus antígenos, sendo dependente da ativação do fator de transcrição NF-kB, como mostrado por Ropert e colaboradores. Diversas moléculas derivadas do T. cruzi, incluindo DNA e as GPI mucinas de formas tripomastigotas, estimulam a produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, envolvendo vias que dependem dos TLR (Toll-like receptors, receptores do tipo Toll) e a molécula adaptadora MyD88, como descrito por Almeida e Gazzinelli, Shoda e colaboradores, Coelho e colaboradores e Campos e colaboradores. Aliberti e colaboradores mostraram que TNF, sinalizando pelo seu receptor p55/TNFR1, desempenha papel crítico na resistência à infecção aguda pelo T. cruzi, controlando a fagocitose do parasito, a produção de NO e de quimiocinas, revelando o papel fundamental desta citocina na formação da inflamação e no controle do crescimento do parasito. Por outro lado, Ferreira e colaboradores, Pérez-Fuentes e colaboradores e Talvani e colaboradores mostraram que os níveis séricos de TNF estão correlacionados à gravidade da disfunção cardíaca nos portadores da doença de Chagas crônicos, sugerindo que o des-balanço na produção de TNF esteja diretamente relacionado à progressão da miocardite chagásica crônica.
TGF-b é uma citocina envolvida no controle da inflamação, síntese e deposição de componentes da matriz extracelular e na formação de fibrose. Estudos recentes de Araújo-Jorge e colaboradores mostraram que níveis séricos de TGF-b estão aumentados em portadores da doença de Chagas quando comparados aos indivíduos não infectados. Também foram observados níveis séricos mais elevados nos pacientes cardiopatas, caracterizados pela menor fração de ejeção ventricular, do que nos indivíduos que apresentam a forma indeterminada da doença. Os autores também mostram que os níveis de TGF-b estão correlacionados à deposição de fibronectina no tecido cardíaco dos portadores da doença de Chagas cardiopatas. Assim, sugerem que TGF-b desempenhe papel na patogenia da doença de Chagas.
Em modelos experimentais de infecção pelo T. cruzi, as citocinas reguladoras IL-10 e TGF-b estão associadas à suscetibilidade à infecção por inibirem a ativação de macrófagos induzida por IFNg. A neutralização de IL-10 endógena resultou no aumento da produção de IFNg e na resistência à infecção o, como descrito por Silva e colaboradores, Cardillo e colaboradores e Reed e colaboradores. Estudos in vitro com macrófagos murinos e humanos mostrou que TGF-b inibe a ativação de macrófagos e o controle de parasitos induzida por IFNg. Também, TGF-b favorece a infecção e o crescimento do parasito em macrófagos. Mais importante, o tratamento de camundongos com TGF-b na fase aguda da infecção resultou em aumento de suscetibilidade, com aumento da parasitemia, como descrito por Silva e colaboradores. Como descrito abaixo, TGF-b tem importante papel no favorecimento do crescimento de parasitos em macrófagos que fagocitam células apoptóticas,
IL-4 estimula a proliferação de células B, regula as reações alérgicas e inibe a ativação de macrófagos. Esta citocina está presente em níveis elevados em linhagens de camundongos suscetíveis à infecção pelo T. cruzi, como mostrado por Eksi e colaboradores e Humphrey e colaboradores. Entretanto, Wirth e colaboradores mostraram que IL-4 aumenta a fagocitose e a atividade microbicida de macrófagos infectados pelo T. cruzi, por um mecanismo até hoje não esclarecido. Michailowsky e colaboradores e Soares e colaboradores utilizando animais deficientes em IL-4 infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi mostraram que na fase aguda da infecção IL-4 favorece a instalação do parasitismo, relacionado à mortalidade. Contudo, na fase crônica da infecção IL-4 é fundamental para o controle do processo inflamatório no tecido cardíaco.
A análise ex vivo de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de portadores da doença de Chagas realizada por Dutra e colaboradores mostrou que os níveis de expressão de mRNA para IL-5, IL-10, IL-13 e IFNg encontravam-se aumentados quando comparados aos indivíduos não-infectados. A estimulação de PBMC destes pacientes por antígenos parasitários (das formas epimastigotas ou tripomastigotas) revelou um aumento na expressão de mRNA para IFNg e baixa expressão de mRNA para IL-10, mostrando que nos portadores da doença de Chagas co-existem citocinas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias e reguladoras.
Bahia-Oliveira e colaboradores relataram níveis significativamente elevados de IFNg em PBMC de pacientes tratados com drogas tripanocidas considerados curados quando comparados a pacientes tratados não curados. Paradoxalmente, no grupo não tratado, composto por pacientes portadores da forma crônica da doença, IFNg esteve mais elevado em pacientes cardíacos do que em pacientes assintomáticos. Sugerindo assim, que esta citocina poderia estar envolvida tanto na proteção quanto no desenvolvimento da patogênese chagásica. Bahia-Oliveira e colaboradores sugeriram o papel do IFNg na eliminação do parasito, em conjunto com a quimioterapia específica, levando à cura parasitológica dos pacientes. Por outro lado, Gomes e colaboradores propuseram que nas formas mais graves da cardiopatia chagásica, IFNg estaria envolvido na indução de resposta inflamatória no tecido cardíaco. Por outro lado, Samudio e colaboradores propuseram que a forma cardíaca crônica da doença estaria associada à produção aumentada de IL-10 em resposta ao parasito, que poderia inclusive regular negativamente a produção de IL-2. Estudando crianças infectadas na fase aguda ou na fase inicial da forma indeterminada, Samudio e colaboradores observaram um padrão Th1 (IFNg) predominante no grupo em fase aguda, enquanto indivíduos em fase indeterminada inicial apresentavam um padrão Th0 (IFNg e IL-4). Segundo os autores, esta indução seletiva de células com padrão Th0 seria importante para o desenvolvimento da resposta imune celular e humoral que controlaria a carga parasitária, contribuindo assim para uma menor morbidade na fase crônica tardia.
Os estudos de biópsias cardíacas de portadores da doença de Chagas crônicos realizados por D’Avila Reis e colaboradores mostraram a presença de TNF em células morfologicamente caracterizadas como macrófagos nas lesões miocárdicas. Reis e colaboradores estudando miocárdio de 25 pacientes cardiopatas crônicos observaram a presença de antígenos do T. cruzi em 68% dos fragmentos estudados. Células CD8+ foram as principais células encontradas nos tecidos, enquanto células CD4+ estavam presentes em menor número. Células expressando IL-2 ou seu receptor eram escassas, sugerindo que pacientes apresentando cardiopatia chagásica crônica possam apresentar um desequilíbrio imunológico com supressão de produção de IL-2. A expressão de IFNg foi intensa, havendo correlação positiva entre o número de células secretando essa citocina e células CD8+, sugerindo serem estas células a principal fonte desta citocina nos tecidos de cardiopatas chagásicos. Foi também observado um número moderado de células secretando IL-4, IL-6 e TNF, sugerindo que a estas citocinas e, em especial, IL-4 produzida por células T CD4+ (Th2), poderiam estar relacionadas à disseminação do parasito.
Cunha-Neto e colaboradores e Abel e colaboradores ao estudarem biópsias endocárdicas de pacientes cardiopatas chagásicos a serem submetidos a transplantes, mostraram predomínio de células produzindo IFNg e TNF em áreas de lesão, sendo os resultados concordantes com os achados imuno-histoquímicos de Reis e colaboradores.
Estudos mais recentes de Gomes e colaboradores demonstram que a produção de IFNg por células CD3+CD4+ periféricas está diretamente associada à gravidade da cardiomiopatia. Por outro lado, Laucella e colaboradores mostraram que a frequência de células CD3+CD8+ circulantes produtoras de IFNg é inversamente correlacionada à gravidade da doença crônica e da doença em pacientes expostos à re-infecção. Estes resultados aparentemente contraditórios devem ser considerados à luz dos papéis descritos para esta citocina nos modelos experimentais, seja controlando o crescimento do parasito, seja favorecendo a inflamação. Gomes e colaboradores também mostraram que a produção de IL-10 por macrófagos/monócitos está associada ao desenvolvimento da forma indeterminada da infecção chagásica.
Por último, as citocinas pró-inflamatórias IFNg e TNF poderiam também modular a expressão de outros grupos de moléculas, como as moléculas de adesão celular e as quimiocinas, envolvidas no controle do crescimento do T. cruzi em macrófagos, assim como no controle do recrutamento e da migração celular, contribuindo para a cronificação da inflamação, como recentemente mostrado por Aliberti e colaboradores, Michailowsky e colaboradores e Gomes e colaboradores. Por outro lado, citocinas com perfil regulador, como TGF-b, poderiam contribuir para o controle da inflamação, mas também para a formação de lesão cicatricial e fibrose por deposição de componentes de matriz extracelular. Assim, a participação de citocinas na patogenia da cardiopatia chagásica merece ainda muitos novos capítulo.
Fibrose
Viana e Chagas demonstraram a não existência de correlação entre parasitismo e reação inflamatória na miocardite chagásica crônica. Contudo, Vianna e Milei e colaboradores mostraram que no tecido cardíaco de portadores da doença de Chagas crônicos os infiltrados mononucleares e as áreas extensas de fibrose são achados comuns. Estes achados foram recentemente reproduzidos por Carvalho e colaboradores no modelo experimental de infecção crônica (mais de 20 anos) de macacos Rhesus pelo T. cruzi (Figura 3).
Figura 3 – Associação entre inflamação e fibrose na infecção crônica pelo Trypanosoma cruzi. (A) Secções seriadas de coração de macaco Rhesus cronicamente infectado pelo T. cruzi mostrando a presença de intenso infiltrado inflamatório monocuclear (H&E, hematoxilina e eosina) e formação de fibrose (revelada pela coloração de vermelho de picrossírius). (B) Presença de colágeno nas áreas de fibrose, revelada pelo método de imuno-histoquímica. Modelo experimental que produz aspectos da fase aguda e crônica da doença de Chagas, segundo Bonecini-Almeida et al., 1991 e Carvalho et al., 2003. Autores: Cristiano Marcelo Espinola Carvalho e Joseli Lannes, IOC, Fiocruz.
De fato, correlação entre intensidade de reação inflamatória e fibrogênese foi descrita por Andrade e colaboradores em modelo experimental murino. Andrade mostrou no estágio sub-agudo da infecção experimental de camundongos BALB/c com a cepa 12SF do T. cruzi depósitos de fibronectina, laminina e colágeno no miocárdio e em espaços perivasculares, sendo a deposição de fibronectina diretamente correlacionada à presença de infiltrados inflamatórios. Na fase crônica os camundongos apresentaram depósitos de fibronectina, laminina e colágenos do tipo III, pró-III e IV. Também, estes autores investigaram o efeito de quimioterápicos nas alterações fibróticas e inflamatórias em camundongos cronicamente infectados com as cepas 21SF e Colombiana. Eles demonstraram que o tratamento na fase crônica da infecção com as drogas benzonidazol e MK-436 (nitroimidazol) resulta na regressão da inflamação e da fibrose, concluindo-se que não apenas a inflamação, mas também alterações fibróticas da matriz extracelular são reversíveis na dependência do controle do parasito. Alguns estudos recentes abordaram a natureza dos fatores fibrogênicos na infecção pelo T. cruzi. Pinho e colaboradores mostraram que antígenos liberados pelo T. cruzi se ligam a fibroblastos e células musculares e induzem aumento de expressão de componentes da matriz extracelular, como fibronectina, laminina e colágeno do tipo I, podendo contribuir para a formação da fibrose cardíaca. Marino e colaboradores mostraram que as células inflamatórias, predominantemente CD8+, encontradas no tecido cardíaco de animais infectados pelo T. cruzi expressão VLA4 (very late antigen 4, CD49d, α4b1) https://en.wikipedia.org/wiki/CD49d e estão envolvidas por uma fina rede de fibronectina (Figura 4).
Figura 4 – Associação entre depósito de matriz extracelular e inflamação com predomínio de células CD8+ no tecido cardíaco na infecção pelo Trypanosoma cruzi. (A) Secções de coração de camundongo não infectado e camundongo infectado pelo T. cruzi mostrando a presença de rede de fibronectina envolvendo as céluals inflamatórias após a infecção; imuno-histoquímica; 200X; (B) células TCD4+ e células TCD8+, em maioria, expressam VLA-4 no tecido cardíaco de camundongo infectado pelo T. cruzi; perfil de citometria de fluxo, segundo dos Santos et al., 2001; (C) Secções seriadas de coração de camundongo infectado pelo T. cruzi mostrando a associação entre a presença de fibronectina envolvendo as células inflamatórias que expressam VLA-4 e que são em sua maioria células TCD8+; imuno-histoquímica; 200X. Modelo experimental que produz aspectos da fase aguda e crônica da doença de Chagas, segundo dos Santos et al., 2001 e Marino et al., 2003. Autores: Paula Vitória Alves dos Santos e Joseli Lannes, IOC, Fiocruz.
Os autores propuseram que citocinas produzidas por estas células poderiam contribuir para a produção de componentes de matriz extracelular e estes poderiam contribuir para a ancoragem de células e citocinas, migração e ativação das células inflamatórias, perpetuando o processo que resultaria na cardiopatia crônica. Mais recentemente, Araújo-Jorge e colaboradores mostraram a correlação entre níveis séricos de TGF-b e fibrose cardíaca em pacientes cardiopatas com reduzida fração de ejeção ventricular, reforçando o papel da fibrose na patogenia da cardiopatia chagásica.
Apoptose
A morte celular programada por apoptose de células imunes, incluindo células T e B, ocorre durante o curso da infecção pelo T. cruzi. Em modelos experimentais infectados há uma significativa perda de células T CD4+ pelo aumento da expressão de Fas (CD95) e Fas-ligante (CD95L), com a subsequente indução de apoptose pela morte celular induzida por ativação, como mostrado por Lopes e colaboradores. Já fibroblastos de camundongo infectados pelo T. cruzi, não são induzidos à apoptose, como descrito por Clark e Kuhn. Por outro lado, cardiomiócitos sofrem apoptose durante a invasão pelo T. cruzi tanto in vitro quanto in vivo, sendo a taxa e a velocidade da morte relacionadas com a cepa do parasito, ocorrendo mais precocemente e em níveis maiores durante a interação com parasitos do tipo T. cruzi I, como descrito por de Souza e colaboradores. Contudo, muitos aspectos moleculares envolvidos na indução de apoptose como resultado da interação cardiomiócitos/T. cruzi precisam ser abordados de modo a se entender a contribuição deste processo para a patogênese da cardiopatia chagásica.
Um estudo realizado por Freire de Lima e colaboradores mostrou que a fagocitose de células apoptóticas por macrófagos infectados resulta na produção de prostaglandina E e TGF-b, com aumento do número de parasitos. Também, a injeção de células apoptóticas em animais infectados resulta em aumento da parasitemia, mostrando que a indução de apoptose e a fagocitose de células apoptóticas pode ser um importante mecanismo imuno-regulador, assim como de escape e perpetuação no T. cruzi no hospedeiro.
Migração celular na infecção pelo T. cruzi
a) Participação e moléculas de adesão celular
O predomínio de células T CD8+ no miocárdio de pacientes na fase crônica da doença de Chagas foi descrito por diversos autores, incluindo D’Avila Reis e colaboradores, Higuchi e colaboradores e Tostes e colaboradores. Contudo, os mecanismos moleculares que determinam a prevalência das células CD8+ neste tecido cardíaco permanecem não esclarecidos. A maioria das células inflamatórias no miocárdio de portadores da doença de Chagas crônicos expressa moléculas de adesão celular como LFA-1 (leukocyte function-associated antigen-1; CD11a/CD18) ligante de ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1; CD54), CD44 ligante de fibronectina e ácido hialurônico e VLA-4 (very late antigen-4; CD49d/CD29, α4β1) ligante de VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1; CD106) e fibronectina. Este resultado levou D’Avila Reis e colaboradores a sugerirem que estas moléculas contribuiriam para a progressão da reação inflamatória mediando a adesão de linfócitos ao endotélio dos vasos do tecido cardíaco ativados por citocinas e por serem importantes na infiltração e localização de células nos sítios inflamatórios. Laucella e colaboradores detectaram um número maior de células VLA-4+ entre os PBMC de portadores da doença de Chagas com cardiopatia grave comparados com aqueles que apresentavam cardiopatia menos grave.
Utilizando modelos de camundongos C3H/HeJ infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi, dos Santos e colaboradores e Marino e colaboradores mostraram a prevalência de linfócitos T CD8+ no tecido cardíaco de animais cronicamente infectados. Neste modelo, tanto as células T CD4+ quanto as CD8+ no tecido cardíaco expressam fenótipo de ativação, que se traduz por uma baixa expressão de L-selectina (CD62L) e alta expressão de LFA-1 e VLA-4 (CD62Llow, LFA-1high, VLA-4high), o que potencialmente permitiria a interação dessas células inflamatórias com o endotélio ativado expressando VCAM-1 e ICAM-1.
Laucella e colaboradores mostraram a presença de níveis elevados de VCAM-1 no soro de portadores da doença de Chagas agudos e crônicos, enquanto ICAM-1 e CD44 têm níveis elevados apenas na fase aguda, apresentando decréscimo na fase crônica da infecção. Apenas os níveis séricos de P-selectina (CD62P) foram associados à gravidade da doença. A liberação das moléculas é afetada pelos mesmos estímulos que causam aumento de sua expressão na superfície celular, tais como IFNg e TNF. Neste contexto, Benvenuti e colaboradores mostraram que a cardiopatia chagásica crônica grave é caracterizada pelo aumento da expressão tanto de ICAM-1 quanto de VCAM-1 no endotélio vascular cardíaco, indução de moléculas do MHC de classe I em cardiomiócitos, e por predomínio de células CD8+ nos infiltrados inflamatórios. De modo interessante, o estudo de Marino e colaboradores em camundongos infectados mostrou que a cinética de aparecimento de ICAM-1 e VCAM-1 no endotélio dos vasos sanguíneos do tecido cardíaco coincide com a cinética de entrada das células inflamatórias neste tecido. Além disso, dos Santos e colaboradores revelaram que uma alta proporção de células T CD8+ circulantes, comparadas às CD4+, expressa LFA-1 e VLA-4, o que poderia facilitar a migração preferencial e predomínio dessas células no miocárdio dos indivíduos cronicamente infectados pelo T. cruzi. A participação de IFNg na modulação da expressão de ICAM-1 e a participação desta molécula na migração celular na infecção pelo T. cruzi e formação do infiltrado inflamatório cardíaco foi confirmada por Michailowsky e colaboradores. Os autores mostraram também que a alta susceptibilidade de animais geneticamente deficientes em ICAM-1 à infecção pelo T. cruzi está associada à diminuição do número de células T CD4+ e CD8+ no tecido cardíaco.
Estes dados mostram que as moléculas de adesão celular participam do processo de migração e formação do infiltrado celular envolvido na resposta imune que controla o parasito, sugerindo, também, que estas moléculas participem da formação da inflamação crônica no tecido cardíaco durante a infecção pelo T. cruzi. Resta a ser esclarecido se há um papel diferencial destas moléculas na imunidade protetora e na formação da inflamação crônica relacionada à gravidade da cardiopatia chagásica.
b) Participação de quimiocinas
Quimiocinas formam uma superfamília de pequenas proteínas (8-10 kD) que desempenham papel importante nas reações imunes e inflamatórias. Como revisto por Luster, Proudfoot e Mantovani, baseados na presença dos resíduos de cisteína, que podem ou não estar intercalados por ácido(s) aminado(s) não conservado(s), representados por X, foram identificadas as famílias CXC (a), CC (b), C (g) e CXXXC (d) de quimiocinas. Estas moléculas interagem com uma família de receptores com 7 domínios trans-membrana em conformação de serpentina ligados à proteína G. De modo geral, as CXC quimiocinas atuam sobre os neutrófilos e as células T e B, enquanto as CC quimiocinas atuam sobre um espectro mais amplo de populações celulares, como monócitos, basófilos, eosinófilos, células T, células dendríticas e células natural killer, não atuando sobre os neutrófilos. Provavelmente todos os tipos celulares, como células endoteliais, cardiomiócitos, fibroblastos, megacariócitos, células T, macrófagos, etc, quando estimulados de forma apropriada e dependente da natureza do estímulo produzem vários tipos de quimiocinas simultaneamente.
As quimiocinas podem ligar-se a várias moléculas encontradas na matriz extracelular com afinidades que variam na faixa de nanomolar a milimolar, como descrito por Fadden e Kelvin. São proteínas básicas e ligam-se com avidez à heparina e a heparan sulfato (carregadas negativamente). Heparan sulfato e proteoglicanas retêm quimiocinas na matriz extracelular e na superfície de células endoteliais, um processo que pode servir para estabelecer um gradiente de concentração local a partir da fonte celular de secreção da quimiocina, assim como estabiliza estas moléculas aumentando seu tempo de ação biológica, como revisto por Luster.
Diversas são as funções biológicas das quimiocinas, incluindo (i) indução de adesão ao endotélio e a componentes da matriz extracelular, (ii) migração quimiotática de leucócitos, (iii) controle da angiogênese, (iv) controle da produção de componentes da matriz extracelular, (v) regulação do crescimento, ativação e diferenciação (incluindo o comprometimento Th1/Th2) de linfócitos, (vi) liberação de enzimas de reservas intracelulares, (viii) formação de radicais de oxigênio, (ix) alteração do citoesqueleto, (x) geração de lipídeos mediadores de sinais intracelulares de ativação e (xi) proliferação de precursores hematopoiéticos e (xii) controle de invasão e multiplicação de agentes patogênicos. Estes efeitos podem ser importantes na mediação da resistência do hospedeiro a patógenos e na imunopatogenia de várias doenças, incluindo, por exemplo, as doenças infecciosas e autoimunes.
As reações inflamatórias observadas tanto durante a fase aguda quanto crônica da infecção pelo T. cruzi parecem ter papel importante na patogenia da doença de Chagas. Nos tecidos afetados, ocorre produção local de vários mediadores imunológicos, causando uma intensa migração dos leucócitos durante a interação entre o parasito e as células do hospedeiro. A busca da compreensão destes processos levou ao estudo da expressão e função de quimiocinas e seus receptores na infecção pelo T. cruzi em portadores da doença de Chagas e modelos experimentais.
A atuação das CC ou b-quimiocinas parece ser particularmente benéfica para o hospedeiro durante a infecção pelo T. cruzi. Lima e colaboradores e Villalta e colaboradores mostraram que macrófagos humanos infectados in vitro pelo T. cruzi produzem CC-quimiocinas. Eles mostraram também que a adição de CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1b ou CCL5/RANTES a macrófagos infectados resulta na destruição intracelular de tripomastigotas por um mecanismo dependente de NO. Estes achados foram confirmados em macrófagos inflamatórios de camundongo por Aliberti e colaboradores. Machado e colaboradores demonstraram que cardiomiócitos de camundongos cultivados in vitro e infectados pelo T. cruzi produzem quimiocinas, iNOS e NO, o que poderia contribuir tanto para o controle do parasito, mas também para a patogenia da cardiopatia chagásica.
De modo interessante, Machado e colaboradores mostraram que o tratamento de cardiomiócitos infectados pelo T. cruzi com TNF resulta em indução ou aumento da expressão de CC-quimiocinas. Também, Aliberti e colaboradores macrófagos infectados e tratados com TNF ou IFNγ expressam mais CC-quimiocinas, enquanto o tratamento com IL-10 ou TGF-β leva à redução da produção destas quimiocinas, sugerindo que as citocinas pró-inflamatórias e reguladoras podem controlar o parasitismo e a formação da inflamação por mecanismos dependentes de quimiocinas.
Em diferentes modelos murinos de infecção aguda e crônica pelo T. cruzi, aumento dos níveis do mRNA de várias quimiocinas (CCL2/MCP-1, CCL3/MIP1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CXCL9/Mig e CXCL10/IP-10) foi observado no tecido cardíaco associado à formação do infiltrado inflamatório, como mostrado por Talvani e colaboradores, Aliberti e colaboradores, dos Santos e colaboradores e Marino e colaboradores. Petray e colaboradores utilizando anticorpos neutralizantes mostraram que a quimiocina CCL3/MIP-1α está envolvida no recrutamento de macrófagos durante a infecção aguda. Contudo, o papel de quimiocinas na migração diferencial das populações celulares na infecção pelo T. cruzi precisa ser melhor explorado. Em estudo recente Roffê e colaboradores mostraram que a imunização de animais com a vacina de DNA expressando CCL4/MIP-1b levou à produção de anticorpos que foram relacionados à exacerbação da inflamação e fibrose cardíaca, sem alterar o parasitismo, revelando que esta quimiocina está relacionada ao controle da inflamação excessiva e da patogenia na infecção pelo T. cruzi.
Concentrações plasmáticas de quimiocinas têm sido correlacionadas com a piora da doença em pacientes com falência cardíaca. Neste sentido, Talvani e colaboradores encontraram que níveis plasmáticos elevados da quimiocina CCL2/MCP-1, mas não de CCL3/MIP1α, estão diretamente correlacionados ao dano cardíaco em portadores da doença de Chagas cardiopatas.
A avaliação da expressão de receptores de quimiocinas na superfície das células mononucleares do sangue periférico de portadores da doença de Chagas realizada por Talvani e colaboradores demonstrou maior frequência de células expressando CCR5 e CXCR4 em portadores da doença de Chagas comparados aos indivíduos não-infectados. Além disso, nas células isoladas de pacientes com cardiopatia grave havia menor frequência de células expressando CXCR4. Estudos de polimorfismo gênico de CCR5 59029A/G realizados por Calzada e colaboradores em pacientes peruanos e Fernandez-Mestre e colaboradores em pacientes venezuelanos revelaram que o alelo G, que resulta em menor expressão de CCR5, é encontrado em maior frequência nos pacientes assintomáticos do que nos cardiopatas. Recentemente, Gomes e colaboradores observaram que as células mononucleares do sangue periférico de pacientes cardiopatas estimuladas in vitro com antígenos do T. cruzi apresentavam um aumento na porcentagem de linfócitos T CD4+ e CD8+ co-expressando CCR5/IFNg, CXCR3/IFNg e CXCR3/TNF. De forma interessante, pacientes assintomáticos apresentavam um aumento da porcentagem de linfócitos T CD4+ e CD8+ co-expressando CCR3/IL-10 e CCR3/IL-4. Portanto, é possível que a gênese da miocardite chagásica crônica esteja relacionada à migração de populações celulares com padrões diferenciados quanto à expressão de receptores de quimiocinas e capacidade efetora das células do sangue periférico para o coração, como proposto por Lannes-Vieira e Marino e colaboradores.
Marino e colaboradores observaram no tecido cardíaco de camundongos C3H/He infectados com a cepa Colombiana o predomínio de linfócitos T CD8+, em relação às células T CD4, expressando CCR5. Visando modular a inflamação cardíaca, os camundongos foram tratados com Met-RANTES (N-terminal-methionylated RANTES), um antagonista seletivo dos receptores CCR1 e CCR5. De forma interessante, os autores observaram que a droga não interferiu no parasitismo, mas reduziu significantemente o número de linfócitos T CD4 e CD8 CCR5+ no tecido cardíaco e a deposição de fibronectina, resultando em aumento de sobrevida dos animais tratados. Assim, esses dados sugeriram fortemente que as células CCR5+ não sejam cruciais para o controle do parasito, mas tenham papel importante na patogênese da cardiopatia chagásica. Mais recentemente, Machado e colaboradores confirmaram o predomínio de células CD8+CCR5+ no tecido cardíaco de animais infectados pelo T. cruzi utilizando o modelo C57BL/6 infectado com a cepa Y, mostrando que o processo resulta da infecção pelo T. cruzi, não sendo um achado de um modelo particular. Além disso, os autores mostraram que a expressão do CCR5 foi aumentada em células T CD8+ pelo estímulo in vitro com antígenos do T. cruzi, mostrando o papel central da persistência do parasito. Em acordo com os dados de Marino e colaboradores, Hardison e colaboradores, utilizando camundongos geneticamente deficientes de CCR5 observaram, particularmente na fase inicial da infecção, intensa diminuição da migração de macrófagos e de células T para o coração. Contudo os autores mostraram que a ausência total de CCR5 resultava em elevada parasitemia e parasitismo cardíaco. Em conjunto, estes dados sugerem CCR5 participa de modo importante no influxo de células inflamatórias para o tecido cardíaco, o que pode ser influenciado pelos fatores genéticos do hospedeiro, e que diferentes sub-populações de células CCR5+ devem desempenhar papéis diversos no controle do parasitismo e na imuno-regulação da miocardite chagásica, o que precisa ser melhor explorado.
Polimorfismo genético e susceptibilidade à cardiopatia chagásica
Estima-se que a suscetibilidade a doenças infecciosas ocorra em uma pequena porcentagem, variando de 0,1% a 10%, da população exposta aos agentes infecciosos. A progressão de uma infecção, assim como o desenvolvimento de diferentes formas clinicas e diferentes graus de gravidade, está relacionada à complexa relação parasito/hospedeiro, que envolve também fatores ambientais (status nutricional, status imune prévio, como exposição a outros patógenos), assim como as características genéticas do patógeno e do hospedeiro. No caso da infecção pelo T. cruzi, o espectro de expressão da doença Chagas varia dos pacientes assintomáticos até os cardiopatas com falha cardíaca grave ou com a forma digestiva com formação de megas. Estas seriam fortes evidências da influência de fatores genéticos na suscetibilidade à infecção pelo T. cruzi.
Considerando o papel fundamental das moléculas de MHC de classe II no processo de apresentação antigênica e controle de microorganismos intracelulares, Fernandez-Mestre e colaboradores realizaram o estudo de polimorfismo gênico das moléculas DRB1 e DQB1 em portadores da doença de Chagas venezuelanos. Estes apresentam frequência diminuída dos alelos DRB1*14 e DQB1*0303 em relação aos indivíduos não infectados, sugerindo o papel protetor independente destas moléculas à infecção crônica. O estudo de pacientes com ou sem cardiopatia revelou maior frequência dos alelos DRB1*01, DRB1*08 e DQB1*0501 e menor frequência de DRB1*1501 nos pacientes com arritmia e falha cardíaca congestiva. Estes dados sugerem que genes de classe II do HLA podem estar associados com o desenvolvimento da infecção crônica e com o dano crônico no tecido cardíaco.
Os diversos achados quando à expressão diferencial de citocinas, quimiocinas, receptores de quimiocinas e fatores efetores nas fases aguda e crônica da doença de Chagas, nos pacientes com as diferentes formas clínicas e em modelos experimentais tornaram estas moléculas alvos dos estudos iniciais de polimorfismo gênico na doença de Chagas.
Níveis séricos de TNF foram relacionados à evolução da doença e à gravidade da cardiopatia chagásica por Ferreira e colaboradores, Peréz-Fuentes e colaboradores e Talvani e colaboradores, sugerindo a participação de TNF na formação da inflamação crônica e na lesão cardíaca. Os estudos de polimorfismo gênico mais frequentemente realizados envolvem a análise de frequência de polimorfismo de base única de nucleotídeo (SNP). O estudo de Beraun e colaboradores da frequência de polimorfismos no promotor de TNF (-308, -244 e –238) em um pequeno número de pacientes peruanos não mostrou nenhuma associação ao comparar pacientes assintomáticos e cardiopatas. O estudo em pacientes mexicanos realizado por Rodríguez-Pérez e colaboradores mostrou uma maior frequência de do polimorfismo TNF-308A, que resulta em transcrição 2 vezes maior do que o alelo TNF-308G, nos portadores da doença de Chagas ao compará-los com indivíduos não infectados pelo T. cruzi. Este estudo revelou, ainda, a maior frequência deste polimorfismo nos pacientes cardiopatas quando comparados aos pacientes assintomáticos. Drigo e colaboradores estudando a frequência do alelo TNF-308A e do alelo TNFa2 de microsatélite, que determinam alta produção de TNF, em 42 portadores da doença de Chagas brasileiros com fração de ejeção ventricular ≤ 40% mostraram que os pacientes expressando estes alelos têm menor tempo de sobrevivência comparados aos pacientes portadores de outros alelos. Contudo, recentemente Drigo e colaboradores analisaram estes mesmo alelos em relação à progressão da cardiopatia chagásica em 160 cardiopatas e 80 assintomáticos pareados em idade e área geográfica. Os pacientes cardiopatas foram agrupados de acordo com a disfunção de ventrículo esquerdo em cardiopatas graves, moderados e sem disfunção cardíaca. Os resultados indicam que os polimorfismos TNF-308A e TNFa2 não estão associados com o desenvolvimento de cardiopatia, nem com a progressão para as formas graves nestes pacientes. Nesta mesma linha de pesquisa, Ramaswamy e colaboradores mostraram que em relação ao gene BAT-1, as variantes nt -22 e nt -48, que são mesmos efetivas na modulação da expressão de TNF e IL-6, estão associadas à suscetibilidade à cardiopatia chagásica. Estes dados sugerem que estas variantes, propostas resultarem em controle menos eficiente da produção de citocinas pró-inflamatórias, podem contribuir para a elevada produção destas citocinas nos portadores da doença de Chagas cardiopatas crônicos.
Conceitualmente, a expressão diferencial de moléculas que participam de mecanismos efetores de macrófagos pode contribuir de forma importante para o resultado do controle do parasito e progressão da doença de Chagas. Os estudos de polimorfismo do gene NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1, proteína de macrófago associada à resistência natural) e no promotor de iNOS/NOS2 realizados em pacientes peruanos por Calzada e colaboradores revelaram a inexistência de diferenças na expressão de diversos alelos entre controles não infectados e portadores da doença de Chagas, assim como indicaram que os polimorfismos destas moléculas não estão relacionados à patogênese da cardiopatia chagásica. Contudo, deve ser considerada a possibilidade de participação destas moléculas direta ou indiretamente nas lesões cardíacas, como por exemplo, no caso da desregulação da produção de iNOS e produção por longo tempo de quantidades elevadas de NO no tecido cardíaco.
Diversos estudos mostraram que a infecção de macrófagos e cardiomiócitos resultam em produção das CC-quimiocinas CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1b e CCL5/RANTES. Estudos de polimorfismo de CCR5 (receptor de CCL3, CCL4 e CCL5) em portadores da doença de Chagas realizados por Calzada e colaboradores e por Fernandez-Mestre e colaboradores revelaram que o alelo CCR5-59029G, associado à baixa expressão de CCR5, é mais frequente em pacientes assintomáticos do que em cardiopatas. Estudos recentes de Marino e colaboradores mostraram que a expressão CCR5 está aumentada na infecção experimental pelo T. cruzi em camundongos, estando esta molécula envolvida no influxo de células inflamatórias no tecido cardíaco. De modo interessante, Gomes e colaboradores mostraram maior frequência de células CCR5+ expressando IFN em pacientes cardiopatas do que em pacientes assintomáticos. Em conjunto estes dados sugerem que o polimorfismo de CCR5 que resulta em maior expressão de CCR5 pode estar associado ao desenvolvimento da forma grave da cardiopatia chagásica, contudo estudos em pacientes brasileiros e com amostras apropriadas (número e pareadas por idade e área geográfica) devem ser realizados.
Conclusões e perspectivas
Em conjunto, os dados acima apresentados sugerem a participação de moléculas envolvidas na apresentação de antígeno e controle do parasito, no processo de migração celular e na regulação da resposta imune na patogenia da cardiopatia chagásica. Estes achados também apontam para o fato de que uma resposta imune com o foco e a intensidade apropriados pode controlar a disseminação do T. cruzi na ausência de doença, como ocorre na maioria dos pacientes. Assim, a compreensão dos eventos moleculares envolvidos na formação da inflamação pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que resultem no controle do parasito e da inflamação que leva à disfunção cardíaca crônica, com estabelecimento do balanço homeostático na interação T. cruzi/hospedeiro e melhor prognóstico para os portadores da doença de Chagas crônica.
Fibrose cardíaca
Mariana Caldas Waghabi
Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: mariana@ioc.fiocruz.br
A evolução das formas clínicas cardíacas da doença de Chagas está bem caracterizada por meio de estudos clínicos e experimentais, sendo classificada em forma aguda, forma indeterminada e cardiopatia chagásica crônica, a qual engloba a miocardiopatia chagásica e a forma arritmogênica da doença, distúrbios da condução átrio ventricular e/ou intraventricular com função ventricular preservada ou pouco alterada.
Fase aguda
Na fase aguda da doença de Chagas observa-se, na maioria dos casos sintomáticos, febre, dor muscular, irritabilidade, conjuntivite, anorexia, vômitos, diarréia, linfadenopatia, hepato-esplenomegalia, miocardite (Figura 1), anemia, trombocitopenia, leucocitose com predominância de linfócitos, funcionamento anormal do fígado e níveis elevados de enzimas cardíacas. Em resultado a esta infecção, o hospedeiro desenvolve ao final de algumas semanas uma resposta imune específica sem que, no entanto, os parasitas sejam completamente erradicados. De qualquer forma, esta resposta imune forte e específica associada à resposta imune inata controla a infecção aguda evoluindo para a fase crônica. A miocardiopatia chagásica é ainda uma doença incurável e segundo dados da OPAS representa uma das principais causas de doenças do miocárdio na América Latina. O envolvimento cardíaco se verifica em aproximados 80 a 90% dos casos agudos, sendo caracterizado, de maneira clínica, por miocardite aguda com taquicardia sinusal, alterações de repolarização e baixa voltagem no eletrocardiograma, dilatação das cavidades ventriculares, disfunção sistólica, derrame pericárdico e sinais de insuficiência cardíaca. A análise histopatológica revela miocitólise focal, necrose e grandes áreas de inflamação. Na vigência de miocardite aguda, a biópsia endomiocárdica pode permitir a visualização das formas amastigotas do parasita, através da coloração de Giemsa, ou por meio de imunoistoquímica específica para alguns antígenos do parasita. O infiltrado inflamatório composto inicialmente por polimorfonucleares é gradativa e predominantemente substituído por células mononucleares, sendo frequentemente associado aos ninhos de parasitas e/ou antígenos parasitários. A despeito da boa evolução da maioria dos pacientes na fase aguda da doença e da parasitemia subpatente, não há comprovação de cura da doença com erradicação do parasito.
Figura 1 – Miocardite.
Fase crônica
Aproximadamente 70% dos indivíduos infectados não desenvolverão doença clínica e permanecerão na chamada forma indeterminada da doença e terão bom prognóstico em longo prazo. Cerca de 30% dos indivíduos infectados desenvolvem os sintomas clínicos da fase crônica da doença de Chagas, que incluem manifestações digestivas, cardio-digestivas, neurológicas e cardíacas, sendo esta última a forma mais significante devido a frequência observada e gravidade. A miocardiopatia crônica (Figura 2) é uma das principais manifestações associadas à morbidade na doença de Chagas, sendo possivelmente desencadeada pela interação parasito-hospedeiro que ocorre durante a fase aguda. É clinicamente evidente e pode incluir aneurimas apicais, disfunção bi-ventricular severa, insuficiência cardíaca progressiva, distúrbios graves da condução atrioventricular e intraventricular, arritmias ventriculares complexas, fenômenos tromboembólicos e cardiomegalia com elevados índices de morbidade e mortalidade, seja por falência miocárdica ou por morte súbita. A morte súbita, que pode ocorrer mesmo em pacientes assintomáticos, representa a principal causa de morte em pacientes com cardiomiopatia chagásica e a insuficiência cardíaca de etiologia chagásica está associada à maior mortalidade do que a insuficiência cardíaca de outras causas. No eletrocardiograma as anomalias mais comuns são bloqueio intraventricular do ramo direito, bloqueio fascicular anterior esquerdo, extrassístoles, alterações nas ondas Q e aumento dos intervalos QRS e QTc. Histologicamente se verifica uma miocardite linfocitária difusa, escassos ninhos de parasitas e fibrose intersticial difusa. Muitas vezes a primeira manifestação da miocardiopatia chagásica pode ser a morte súbita ou fenômenos tromboembólicos pulmonar ou sistêmico. A fibrose (Figura 3) é uma das manifestações mais significativas da cardiopatia chagásica crônica e encontra-se associada a infiltrados inflamatórios e cardiomiócitos em degeneração.
Figura 2 – Infiltrado inflamatório no coração.
Figura 3 – Cardiopatia humana.
Fibrose
Mecanismos de desenvolvimento, citocinas e quimiocinas envolvidas
A fibrogênese pode ser definida como a produção de componentes da matriz extracelular principalmente por fibroblastos. Ela ocorre durante o processo fisiológico de remodelamento tecidual ou pode ser induzida após danos teciduais, causados, por exemplo, por agentes patológicos. O processo de reparo tecidual está entre os mecanismos naturais de proteção dos organismos, contudo, quando o estímulo lesivo é mantido por períodos prolongados, ocorre a perda do balanço entre a produção e a degradação dos componentes da matriz extracelular, levando à substituição gradual do tecido funcional por um tecido conjuntivo. O excesso de produção e deposição de componentes da matriz extracelular dá origem ao processo denominado fibrose, que é disparado em inúmeras patologias, incluindo a doença de Chagas. Os mecanismos que regulam a fibrose progressiva em diferentes órgãos e tecidos são semelhantes e possuem características comuns, como o acúmulo progressivo de tecido conjuntivo e deposição excessiva de colágeno, resultando em substituição da arquitetura normal do tecido e comprometimento de sua atividade funcional. Este processo é mediado por citocinas e fatores de crescimento solúveis que regulam a migração, proliferação e diferenciação celular, assim como a síntese e degradação de componentes de matriz extracelular.
O desenvolvimento do tecido fibroso pode se dar na presença ou ausência de células parenquimais. A fibrose reparativa ou de cicatrização é uma adaptação à perda de parênquima sendo crucial para a prevenção da destruição estrutural do tecido. A extensão do tecido fibroso é inversamente proporcional à capacidade regenerativa das células parenquimais. Após danos de necrose, como ocorre no infarto, o tecido do miocárdio responde com inflamação e reparo. Durante este processo, o tecido necrosado é substituído por tecido de granulação que se torna visível macroscopicamente. Os cardiomiócitos são terminantemente diferenciados com capacidade de proliferação extremamente reduzida. Esta característica leva a restrições ao crescimento regenerativo em situações de demanda aumentada e/ou perda celular, sendo em parte compensada pelo aumento global da sua dimensão e estrutura celular, o que pode levar a progressiva disfunção e falência do coração. Na fibrose cardíaca, o colágeno fibrilar ocupa o espaço das células perdidas, servindo como tecido de substituição. Além desta deposição de colágeno no sítio de tecido danificado, como uma resposta de cicatrização (fibrose reparativa), também ocorre um aumento na deposição de colágeno distal a área de infarto (fibrose reativa).
O TGF-β (fator de transformação do crescimento-β) é uma das principais citocinas envolvidas na regulação da formação e degradação de matriz extracelular. O TGF-β participa da regulação da fibrose por estimular (1) a quimiotaxia dos fibroblastos, (2) a transformação de fibroblastos em miofibroblastos, (3) a transição epitélio-mesenquimal, (4) a produção de componentes de matriz extracelular; tais como fibronectina, laminina, colágeno, vitronectina e trombospondina, (5) a inibição da síntese de metaloproteases e (6) a produção dos inibidores teciduais das metaloproteases (TIMPs). A produção de TGF-β em áreas próximas a lesão tissular pode contribuir para a hipertrofia de miócitos e para o processo de deposição de proteínas de matriz extracelular.
A inibição da degradação de matriz é devida à diminuição da atividade proteolítica pericelular com aumento da expressão de TIMPs. Quando administrado in vivo, o TGF-β pode induzir fibrose no sítio de administração. No fígado, tem importante papel na fisiopatologia da fibrogênese hepática. Em camundongos transgênicos com superexpressão hepática de TGF-β ativo, observam-se lesões teciduais múltiplas, incluindo fibrose hepática e extensa glomerulonefrite. Outras importantes funções celulares incluindo diferenciação, adesão, migração celular e resposta imune também são controladas por este mediador.
Além desta citocina, outras também participam deste concerto de atividades biológicas envolvidas na gênese e regulação da fibrose incluindo as citocinas (i) pró-fibrogênicas, como o fator de necrose tumoral (TNF), a endotelina, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDFG), o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), a proteína quimioatraente a monócitos-1 (MCP-1), a proteína inflamatória de macrófagos 1-alfa (MIP-1a), a interleucina 1 (IL-1), a interleucina 5 (IL-5), a interleucina 8 (IL-8) e a interleucina 13 (IL-13) e as (ii) anti-fibrogênicas como o interferon gama (IFNg).
Entre as moléculas pro-fibrogênicas, destacamos a endotelina que é um peptídeo vasoconstritor de 21 aminoácidos associado a fibrose de diferentes tecidos, incluindo o cardíaco onde induz um aumento na síntese de colágeno por fibroblastos. O tratamento com antagonistas do receptor celular de endotelina reduz a fibrose do miocárdio em camundongos com hipertensão. Há relatos da interação entre diversos sistemas sinalizadores presentes no tecido cardíaco incluindo a endotelina, o TGF-β e a adenosina trifosfato (ATP) via receptores purinérgicos. A superexpressão de TNF em camundongos transgênicos induz uma hipertrofia ventricular pelo aumento da deposição de colágeno no miocárdio, sendo este efeito atenuado pelo tratamento com anticorpo anti-TNF, sugerindo que esta citocina pró-inflamatória tenha um papel crítico no remodelamento da matriz extracelular, podendo ser um potencial alvo para imunoterapia. A ação anti-fibrogênica do IFNg é de particular interesse por sua dupla função no processo de fibrose podendo estimular macrófagos a produzir citocinas fibrogênicas e ao mesmo tempo inibir a expressão gênica de colágeno e a proliferação de fibroblastos.
Fibrose na doença de Chagas
Evidências demonstram que o Trypanosoma cruzi interage com componentes da matriz extracelular do hospedeiro produzindo a lise de produtos que apresentam papel importante na mobilização do parasita e em sua infectividade. Já foi descrita a expressão aumentada de componentes da matriz extracelular em tecidos cardíacos de portadores da doença de Chagas crônica (Figura 4). Componentes da matriz podem adsorver antígenos do parasita e citocinas que podem contribuir para o estabelecimento e perpetuação da inflamação. Em 2002, Pinho e colaboradores demonstraram que a adsorção de antígenos do parasita por células sensibilizadas levava a um aumento na expressão de componentes de matriz tais como fibronectina, laminina e colágeno tipo I. Este dado reforça a ideia de que antígenos liberados por T. cruzi possam estar envolvidos no estabelecimento da inflamação, sensibilizando células hospedeiras não- infectadas, levando a uma resposta imune contra os antígenos do parasita. Algumas quimiocinas já foram caracterizadas como envolvidas no desenvolvimento patogênico da miocardite chagásica. Entre estas, destaca-se o aumento na expressão de CCL5/RANTES e CCL3/MIP-1alpha, e seu receptor CCR5, no coração de camundongos infectados pelo T. cruzi, sugerindo um papel de CC- quimiocinas na miocardite desencadeada pelo T. cruzi.
Figura 4 – Fibrose cardíaca.
No coração, além dos fibroblastos, também os cardiomiócitos secretam citocinas fibrogênicas como TGF-β e FGF. Essas citocinas associadas àquelas produzidas pelas células inflamatórias recrutadas para o tecido inflamado podem contribuir para o desencadeamento e manutenção do processo fibrótico. Além da elevada expressão de colágeno durante a fase crônica da doença de Chagas, outros componentes de matriz extracelular também têm sua expressão aumentada durante a evolução do processo de fibrose, tais como laminina e fibronectina. Além disso, em resposta a injúria, TGF-β promove a migração e proliferação de fibroblastos requerida para a regeneração tecidual.
A relação entre elevados níveis de TGF-β e fibrose cardíaca em portadores da doença de Chagas e nos modelos experimentais, pode ser relacionada com estudos em que também é observado o aumento na expressão proteica e de RNAm para TGF-β e seus receptores celulares em regiões infartadas do miocárdio em resposta à cicatrização. Este aumento da expressão de RNAm para TGF-β 1 em ratos induz uma expressão elevada de CTGF (connective tissue growth factor) no tecido infartado. As células provavelmente responsáveis pela produção de CTGF são miofibroblastos e fibroblastos. O aumento da expressão de CTGF está associado à expressão de RNAm para colágeno, indicando que CTGF apresenta um papel significante no desenvolvimento patológico do infarto.
Os níveis plasmáticos de TGF-β nos pacientes cardiopatas crônicos alternam-se significativamente, elevando-se de 0,44 ng/mL nos indivíduos não infectados para 21,4 ng/mL nos pacientes crônicos. Embora todos os portadores da doença de Chagas apresentem variações positivas nos níveis de TGF-β, observa-se uma tendência de níveis mais elevados em pacientes com manifestações mais graves de disfunções cardíacas evidenciadas por diferentes parâmetros clínicos, tais como eletro e/ou ecocardiograma. Estudos mais recentes não confirmaram essa correlação possivelmente devido aos medicamentos em uso pelos pacientes. Concomitantemente aos altos níveis de TGF-β nos pacientes cardiopatas, observa-se através de ensaios imunoistoquímicos uma intensa fibrose cardíaca, que pode ser visualizada pelo aumento na expressão de elementos de matriz extracelular, como a fibronectina, além da forte expressão (no núcleo) da proteína Smad 2 fosforilada (PS-2) envolvida na via de sinalização de TGF-β (Figura 5).
Figura 5 – Imunomarcação contra PS-2 nuclear.
Alguns autores descrevem que a acumulação progressiva de colágeno intersticial interfere na conformação normal do miocárdio, levando a perda na sincronia das contrações ventriculares durante a sístole, e contribuindo para um espectro de disfunções ventriculares que envolvem tanto a fase sistólica quanto diastólica do ciclo cardíaco. A fibrose do miocárdio está provavelmente envolvida na formação de arritmias (taquicardia ventricular ou fibrilação), causas majoritárias de morte súbita em portadores da doença de Chagas crônica. O aumento das fibras de colágeno também interfere nas propriedades elétricas do miocárdio. A fibrose bloqueia o impulso cardíaco, que cicla por uma via alternativa, diminuindo a velocidade da condução. Além disso, os grossos septos de colágeno entre os feixes musculares poderiam interferir com a condução lateral do impulso elétrico, como demonstrado em corações senescentes em comparação com indivíduos jovens.
Além da fibrose, alterações no sistema de condução do impulso elétrico representam outra manifestação importante da miocardiopatia chagásica. Adicionalmente, outro possível papel do TGF-β poderia estar relacionado à mudança da plasticidade celular pela perda de contatos celulares mediada por alteração de proteínas juncionais, como a conexina. Esta hipótese é validada pelo fato de que em diversos sistemas já estudados, o TGF-β é capaz de afetar a comunicação intercelular mediada por junções do tipo “gap”, que são bases estruturais da transmissão do impulso elétrico no coração.
Em cardiomiócitos infectados pelo T. cruzi in vitro e in vivo, pode-se observar uma forte redução na marcação de conexina-43 (Cx43), e a consequente diminuição da condução elétrica nestas células; além disso, também foi demonstrada a participação direta das junções do tipo gap na alteração de condução elétrica e arritmogênese no miocárdio; e que TGF-β participa da desorganização das placas de Cx43 em coração de camundongo e rato. Os distúrbios de sinalização em junções gap podem levar a alterações na propagação do impulso entre cardiomiócitos e gerar arritmias ventriculares no coração miopático.
Andrade e colaboradores foram os primeiros a descrever um modelo experimental murino para estudos de patogenia, no qual demonstraram na fase aguda da infecção experimental em camundongos BALB/c com a cepa 12SF do T. cruzi deposição de fibronectina, laminina e colágeno no miocárdio e em espaços perivasculares, margeando áreas de infiltrados inflamatórios.
Os mecanismos patogênicos envolvidos na cardiopatia chagásica são complexos e ainda não foram totalmente elucidados. Acredita-se que o parasita apresente um papel fundamental durante as fases aguda e crônica da doença, exercendo um efeito imuno supressivo, causando dano tissular atuando diretamente nas células infectadas e indiretamente por induzir o desenvolvimento de fenômeno autoimune e de hipersensibilidade. Desta forma, este processo favorece a persistência de inflamação cardíaca e a fibrose reparativa consequente, levando a uma perda funcional importante do órgão ao longo dos anos. O uso terapêutico da vacina rAdVax com antígenos do T. cruzi demonstrou efeito promissor na fase crônica experimental com reversão de lesões cardíacas, incluindo fibrose.
O TNF também se destaca como uma importante citocina com envolvimento na disfunção cardíaca chagásica. Modelos experimentais de infecção crônica desenvolvidos por Lannes-Vieira e colaboradores demonstraram aumento nos níveis circulantes de TNF e de óxido nítrico, ambos associados à gravidade do acometimento cardíaco. Esses modelos se mostram eficientes na busca de novos compostos terapêuticos com enfoque nas manifestações clínicas observadas na fase crônica da doença. Foi demonstrada a eficiência da terapia combinada de benzonidazol com o agente imunoregulador, pentoxifilina, na cardiomiopatia chagásica crônica experimental, com potencial efeito na redução de fibrose, miocardite, carga parasitária e melhora nas alterações elétricas. Esses achados suportam a importância de se utilizar tratamentos combinados com ação direta no agente etiológico e que regulem a resposta imune exacerbada para melhorar o prognóstico dos pacientes portadores da cardiopatia chagásica crônica.
Forma digestiva
Avanços e perspectivas sobre a patogenia da forma digestiva da doença de Chagas
Rodrigo Correa-Oliveira
Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz
E-mail: correa@cpqrr.fiocruz.br
Alexandre Barcelos Morais da Silveira
Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz
E-mail: alec@cpqrr.fiocruz.br
Débora d’Ávila Reis
Departamento de Morfologia, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais
E-mail: reisdda@icb.ufmg.br
Megaesôfago, megacólon e cardiopatia são causas de morbidade e mortalidade na fase crônica da doença de Chagas. Nosso laboratório tem se interessado especialmente pelo estudo da imunopatologia do megaesôfago e megacólon chagásicos. Estudos epidemiológicos em áreas endêmicas do Brasil demonstraram que 8-10% dos pacientes crônicos possuem a forma digestiva da doença.
Pacientes portadores da forma digestiva apresentam uma série de sintomas relacionados à obstrução do órgão. Tanto no megaesôfago quanto no megacólon, os órgãos exibem grande aumento do lúmen e hipertrofia da camada muscular. Análises histológicas dos órgãos afetados têm demonstrado lesões inflamatórias do sistema nervoso entérico (SNE) (Figura 1), associadas com uma grande redução no número de neurônios. Segundo Koberle, para o desenvolvimento do megaesôfago é necessária a redução de cerca de 85% no número de neurônios no órgão, enquanto a doença no cólon está associada a uma perda neuronal de no mínimo 50%.
Figura 1 – Representação esquemática da organização do sistema nervoso entérico.
Embora o mecanismo de lesão neuronal continue obscuro, a frequente observação de ganglionite e periganglionite em pacientes com mega aponta para a participação de células do sistema imune nesse processo. O papel do parasita tem sido investigado, tanto em processos inflamatórios da fase aguda quanto em lesões da fase crônica. Demonstramos a presença de kDNA do parasita no esôfago de pacientes crônicos portadores de megaesôfago e megacólon (dados não publicados), demonstrando assim uma forte associação entre o desenvolvimento do mega e a persistência do parasita na fase crônica. Em estudos de LSSP-PCR (Low-stringency Single Specific Primer-PCR) demonstramos ainda similaridade entre as assinaturas de kDNA obtidas de parasitas no esôfago de dois pacientes distintos portadores de megaesôfago severo.
Mais recentemente observamos que o kDNA de Trypanosoma cruzi é detectado também em amostras de esôfago ou cólon de cerca de 50% dos pacientes não portadores de mega, ao contrário do que tinha sido demonstrado por estudos imunohistoquímicos. Essas observações nos suscitaram a re-discutir a patogênese do mega sob um outro aspecto. Para compreender esse processo patológico, devemos analisar, não apenas a presença do T. cruzi no órgão, mas também considerar a variabilidade de cepas do parasita e outros fatores relacionados ao hospedeiro, como a genética, a resposta imune e o processo de desnervação.
Em trabalhos posteriores observamos uma forte associação entre presença de células com potencial citotóxico, processo de desnervação e desenvolvimento do megaesôfago, sendo que evidências da ocorrência de mecanismos de citotoxicidade semelhantes foram também evidenciados posteriormente no megacólon chagásico. Alguns indivíduos não portadores de mega também apresentaram desnervação e inflamação, porém menos intensas. No entanto, certos pacientes não portadores de mega e sem qualquer sintoma digestivo, apresentaram uma redução no número de neurônios do SNE próxima do limite estabelecido anteriormente por Koberle. Esses dados nos incitaram a iniciar um estudo neuroquímico do SNE, comparativo, em pacientes portadores e não portadores de megacólon. Sabendo que o SNE contém cerca de 10 a 100 milhões de neurônios, com uma grande variedade de neurotransmissores e/ou neuropeptídeos, levantamos a hipótese de que, para o desenvolvimento do megacólon, era necessário acontecer uma destruição seletiva de determinadas classes de neurônios, o que afetaria o peristaltismo e o tônus vascular e consequentemente propiciaria o desenvolvimento da patologia.
De fato, nosso grupo foi o primeiro a demonstrar que o desenvolvimento do megacólon chagásico parece ser explicado não apenas pela taxa de morte neuronal, mas também pela frequência de destruição de cada classe de neurônio. A destruição seletiva de neurônios motores inibitórios nNOS+ e VIP+ e o aumento da frequência de neurônios substância P+ parecem propiciar o desenvolvimento dessa patologia (Figura 2). Demonstramos ainda que a destruição de células enterogliais na infecção chagásica parece acontecer precocemente e não se co-relaciona com desenvolvimento do megacólon e que possivelmente as células enterogliais GFAP+ participem da modulação do processo inflamatório e, consequentemente, da proteção neuronal e do controle do desenvolvimento do megacólon chagásico.
Figura 2 – Demonstração imunoistoquímica da codificação neuroquímica de neurônios em gânglios do plexo mientérico do cólon de indivíduos não infectados e de portadores de megacólon. Foi utilizada dupla marcação para corpos neuronais (vermelho – HuC/HuD) e para o marcador neuroquímico (verde). Não houve diferenças entre o número de corpos neuronais reativos a calretinina (neurônios aferentes) entre indivíduos não infectados (A) e pacientes portadores de megacólon (A’). O mesmo foi observado quanto a neurônios que expressam NPY (interneurônios) (B e B’) e ChAT (neurônios motores excitatórios) (C e C’). A análise de neurônios que expressam Substância P (neurônios motores excitatórios) revelou que pacientes portadores de megacólon apresentaram um maior número de neurônios expressando este neuropeptídeo (D’) em relação aos indivíduos não infectados (D). Por outro lado, somente um número reduzido de neurônios expressando VIP e NOS (neurônios motores inibitórios) foram identificados em pacientes portadores de megacólon (E’e F’) em relação aos indivíduos não infectados (E e F).
As alterações sofridas pela integração neuroimune tem sido alvo de pesquisas em diversas patologias que atingem o trato gastrintestinal. Na doença de Chagas, acreditamos que o estudo do sistema nervoso entérico, bem como sua associação com o processo inflamatório poderá fornecer subsídios para compreensão de alterações neuroimunes que possam estar de alguma forma envolvidas no desenvolvimento do mega.
Os neuropeptídeos encontrados no SNE possuem atividade considerável sobre o sistema imune. Por exemplo, a substância P é considerada uma proteína que além de neuromediador, possui ação pró-inflamatória nas células do sistema imunológico. Ela estimula a proliferação linfocitária, o tráfego de linfócitos através dos linfonodos e a produção de IL-2. Além disto, a substância P age como um dos ativadores de células Natural Killer (NK) e possui ação quimiotática para mastócitos, macrófagos e neutrófilos. Já o neuropeptídeo VIP inibe a resposta de células NK e de linfócitos T, bem como a produção de IL-2 e IL-4 por estas células. Por outro lado, VIP estimula a quimiotaxia de macrófagos e a produção de IL-5 por linfócitos. Nesse contexto, é interessante salientar nossos achados de aumento da frequência de neurônios substância P+ no cólon de portadores de megacólon, o que sugere sua participação na manutenção do processo inflamatório da fase crônica.
Ressaltamos os dados preliminares do nosso laboratório, resultantes de estudos de imunohistoquímica para a proteína GAP-43, marcador de regeneração neuronal (Figura 3). Os resultados preliminares obtidos sugerem que esse processo de plasticidade neuronal esteja ocorrendo no cólon de pacientes portadores da infecção crônica. A partir desses dados uma nova linha investigativa abriu-se no estudo da patologia do megacólon chagásico. Para a compreensão do desenvolvimento dessa patologia, devemos avaliar não apenas o grau de destruição das diferentes classes neuronais, mas também a taxa de regeneração das mesmas.
Figura 3 – Demonstração da expressão de GAP-43 em um gânglio nervoso do plexo mientérico do cólon de um indivíduo não infectado e de um paciente chagásico portador de megacólon. Foi realizada uma dupla marcação com um o marcador pan-neuronal HuC/HuD (Vermelho) e com o marcador de regeneração GAP-43 (verde). (A) Indivíduos não infectados apresentam uma pequena expressão de GAP-43 limitada quase sempre ao interior do corpo neuronal. (B) Pacientes portadores de megacólon apresentam uma maior quantidade de neurônios que expressam GAP-43 comparados a indivíduos não infectados. Além disto, pacientes expressam GAP-43 não somente nos corpos neuronais, mas também em fibras nervosas.
Outro aspecto importante a ser avaliado é a expressão de neurotrofinas. O fator de crescimento neuronal (NGF) foi a primeira neurotrofina a ser descrita, uma vez que seu papel no desenvolvimento, diferenciação e manutenção de neurônios sensitivos e simpáticos foi estabelecido. Uma série de células produz o NGF, entre as quais podemos destacar os neurônios, as células da glia, células musculares, fibroblastos e até mesmo algumas células do sistema imunológico, tais como os linfócitos B e linfócitos T. Além do NGF, uma série de neurotrofinas passou a ser caracterizada devido a seus efeitos sobre o tecido nervoso. Dentre elas destacamos o Fator Neurotrófico Ciliar (CNTF), os Fatores de Crescimento Fibroblástico acídico (a-FGF) e básico (b-FGF), e o Fator Neurotrófico Derivado de Células Gliais (GDNF), entre outros.
O GDNF é um polipeptídeo originalmente conhecido pela sua ação estimulante em neurônios do sistema nervoso central, como neurônios dopaminérgicos mesencefálicos e neurônios motores. O GDNF é também responsável pelo desenvolvimento e sobrevivência de neurônios entéricos. Foi demonstrado que os efeitos tróficos substanciais do GDNF sobre populações de neurônios autonômicos, sobretudo sobre neurônios do SNE, sendo esses efeitos distintos daqueles produzidos por outras neurotrofinas e fatores neurotróficos. Como ocorre com o NGF, neurônios, células da glia e células musculares são os principais produtores de GDNF.
Ao desvendarmos certos aspectos ligados ao estabelecimento e desenvolvimento do megacólon chagásico, acreditamos que estaremos contribuindo não só para a aplicação de novas metodologias preventivas e terapêuticas na doença de Chagas, mas sim em um amplo espectro de doenças que afligem o sistema digestivo, como doença de Chron, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável e doença de Hirschsprung. Além disto, esperamos que os dados resultantes de nossa linha de pesquisa possam servir como orientação para futuros trabalhos experimentais a cerca dos mecanismos patogenéticos da infecção pelo T. cruzi.
Sistema Cinina
Ativação do Sistema Cinina pelo Trypanosoma cruzi: um papel para a cruzipaína na imunopatogênese da doença de Chagas experimental”
Julio Scharfstein
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
E-mail: scharf@biof.ufrj.br
Neste módulo, faremos um relato sobre a evolução das pesquisas sobre a estrutura e função biológica das cisteíno proteases do Trypanosoma cruzi. Identificada com um alvo terapêutico em meados da década de 90, a isoforma majoritária, a cruzipaína, é hoje reconhecida como um fator de virulência do T. cruzi. Além de gerar peptídeos que estimulam a internalização de tripomastigotas por células cardiovasculares, a atividade enzimática da cruzipaína é essencial para o desenvolvimento e diferenciação de amastigotas intracelulares. Estudos mais recentes indicam que a cruzipaína gera peptídeos pró-inflamatórios nos sítios de infecção, alertando as células sentinelas do sistema imune inato sobre a presença de tripomastigotas no tecido intersticial. Esta percepção veio à tona devido a caracterização de cininogênios (precursores da bradicinina) como substratos naturais da isoforma majoritária (cruzipaína). A narrativa deste texto será dividida em duas partes: na primeira, descreverei os antecedentes desta pesquisa. Em seguida, descreverei achados mais recentes, demonstrando que a ativação do Sistema Cinina pelo T. cruzi tem impacto na imunopatogênese da doença de Chagas experimental.
Caracterização molecular da Cruzipaína: antecedentes históricos
Em meados da década de 70, Erney Camargo e colaboradores foram os primeiros a descrever a presença de enzimas proteolíticas em extratos do T. cruzi. Pouco depois, Rangel e colaboradores descreveram parcialmente as propriedades fisico-químicas de uma tiol-protease de epimastigotes. No final daquela mesma década, houve uma convergência entre 3 linhas de pesquisa que até então vinham se desenvolvendo paralelamente em Buenos Aires, Rio de Janeiro e São Francisco. Em trabalho pioneiro, Cazzulo e seus colaboradores purificaram e caracterizaram as propriedades enzimáticas da principal cisteíno protease lisossomal do T. cruzi, designada “cruzipaína”. Pouco depois, McKerrow e colaboradores (UCSF) descreveram a sequência parcial de oligonucleotídeos de uma cisteíno protease de T. cruzi que apresentava a tríade catalítica característica (Cys 25, His 159 e Asn 175) das enzimas da superfamília da papaína. Na mesma época, a nossa equipe demonstrou que a cruzipaína era idêntica à GP57/51, uma glicoproteína préviamente definida pela nossa equipe como um antígeno dominante de T. cruzi. Além da GP57/51 apresentar uma sequência N-terminal virtualmente idêntica à cruzipaína, obtivemos evidências que tratava-se de uma tiol-protease da família papaína (sensível a E-64 e cistatina), capaz de degradar substratos protéicos de alto peso molecular, tanto em pH neutro quanto ácido. Empregando anticorpos monoclonais a-GP57/51, verificamos que o antígeno tinha um padrão de localização eminentemente lisossomal (reservossomas).
Antes de descrever os conhecimentos obtidos sobre relações estrutura-função da cruzipaína, é oportuno mencionar os antecedentes históricos desta pesquisa. Em 1983, Mendonça-Previato e colaboradores haviam isolado e caracterizado diversas frações provenientes de extratos aquosos (fervidos) de epimastigotas. Dentre outros, o glicoconjugado de 25.000 daltons, denominado GP25, destacava-se pela presença de alto teor de cadeias de oligosaccarídeos O-ligados. Ao analisarmos a antigenicidade da GP25, constatamos que a glicoproteína poderia ser empregada como ferramenta no sorodiagnóstico da Doença de Chagas. Aproveitando a disponibilidade de altas quantidades da GP25, isolamos os anticorpos IgG humanos através de cromatografia de afinidade. A análise do perfil de expressão da GP25 revelou a presença de epitopos em todos os estágios de morfogênese do parasita. Epimastigotas exibiram forte densidade de epitopos na superfície celular, mas a reação com a superfície de tripomastigotas (formas sanguícolas, BFT) foi apenas discreta. A despeito da discreta reação de anticorpos IgG humanos a-GP25 com a superfície de BFT, foi surpreendente constatar que estes anticorpos foram capazes de reduzir significativamente a infecção de células de músculo liso humano (cultivo primário). Curiosamente, ensaios realizados paralelamente com fibroblastos (cultivo primário) obtidos dos mesmos doadores mostraram que a infectividade do parasita não havia sido prejudicada pela ação destes anticorpos. Evidentemente, em 1982, não era possível explicar os motivos do efeito diferencial de anticorpos IgG humanos a-GP25 nestes dois modelos de interação celular. Além disso, a caracterização molecular da GP25 vinha se mostrando penosa, porque a extremidade N-terminal da (glico)proteína parecia estar bloqueada, inviabilizando o seu sequenciamento. Além disso, o padrão isoelétrico da GP25 era bastante complexo, sugerindo a existência de microheterogeneidade estrutural. Estas dificuldades foram em parte contornadas com a obtenção de anticorpos monoclonais a-GP57/51. A análise do padrão de imunoprecipitação de antígenos marcados metabolicamente com [35 S]-metionina revelou um dado importante: os lisados de epimastigotas que haviam sido previamente tratados com cocktail de inbidores de protease apresentaram apenas duas bandas características de 57/51.000 daltons, referidas a partir de então como antígeno GP57/51. A premissa que a GP57/51 era sensível à proteólise foi confirmada quando os inibidores de protease foram omitidos da preparação de lisados celulares: nestas condições, o anticorpo monoclonal precipitou fragmentos antigênicos de MW~25 KDa. Depois de comprovar que os anticorpos a-GP25 monoclonais ou policlonais reagiam fortemente com a GP57/51 purificada por FPLC, concluímos que os epitopos dominantes da GP25 eram compartilhados com a GP57/51. Com base neste conjunto de observações, deduzimos que a GP57/51 (cruzipaína) era o produto biosintético primários produzidos por epimastigotas. Como corolário, deduzimos que a GP25 era um produto estável gerado pela proteólise da cruzipaína.
Propriedades estruturais e funcionais da cruzipaína
Coube a equipe de Cazzulo determinar a sequência (130 ácidos aminados) do domínio C-terminal da cruzipaína. Contendo vários sítios preditivos de N/O-glicosilação, esta extensão C-terminal une-se ao domínio catalítico (central) através de uma sequência (tipo-dobradiço) rica em treonina e prolinas. Conforme prevíamos, os flancos da dobradiça continham sequências sensíveis à clivagem por mecanismos autoproteolíticos.
Pouco tempo depois, o sequenciamento completo de clone de DNA genômico mostrou que a cruzipaína é um polipeptídeo de cadeia unica sintetizada como uma pre-pro-enzima. A região PRE é composta por um peptídeo hidrofóbico capaz de direcionar a molécula para o retículo endoplasmático. Tal como ocorre com outros membros da superfamília papaína, o segmento PRO-peptídico é fundamental para o processo de enovelamento da proteína precursora. Além disso, segmento PRO liga-se ao domínio catalítico de diversas enzimas da família papaína, obstruindo o acesso de substratos ao seu interior da fenda catalítica. Conforme descrito para outras enzimas da família C1, era previsto que a cruzipaína deveria ter uma fenda com formato em “V” estabilizada pela interação de 2 subdomínios adjacentes.
Inicialmente, a tarefa de obter formas enzimaticamente ativas da cruzipaína a partir de corpos de inclusão não foi bem sucedida, fato que retardou a análise de sua estrutura tri-dimensional. Apesar disso, a obtenção da proteína recombinante inativa permitiu a retomada dos estudos imunológicos. Após obter linhagens contínuas de linfócitos CD4 isolados de portadores da doença de Chagas, avaliamos a especificidade antigênica destas linhagens usando um painel de peptídeos sintéticos sobrepostos, cobrindo o domínio catalítico e C-terminal. Estes estudos revelaram a presença de epitopos T imunodominantes no domínio central. Anos depois, a especificidade fina de linhagens de linfócitos T CD8+ intracardíacos de portadores da doença de Chagas foi caracterizada pela equipe dirigida por Cunha-Neto. Os resultados dos estudos com pacientes indicaram que os epitopos T concentram-se no domínio central (catalítico) (18,20), enquanto que os epitopos reconhecidos por anticorpos IgG humanos se concentram no domínio C-terminal (i.e., na GP25). Anos depois, estudos realizados em modelos de vacinação experimental indicaram que a cruzipaína tem efeito imunoprotetora. Mais recentemente, pesquisadores da Universidade de Córdoba demonstraram que o bacKground genético de camundongos influencia o padrão TH desenvolvido por animais imunizados com formas enzimaticamente inativas da cruzipaína.
Enquanto a equipe da UCSF investia esforços para obter a forma ativa da cruzipaína recombinante, o nosso grupo prosseguiu estudando a especificidade de substrato da cruzipaína natural isolada de epimastigotas (cepa Dm28c). Tal como proposto pela equipe de Cazzulo, na Argentina, os ensaios enzimáticos realizados por Ana Paula Lima e colaboradores confirmaram que a cruzipaína era uma enzima relacionada com a catepsina L. Refletindo as particularidades conformacionais desta enzima, registramos que a sua atividade (tipo-catepsina L) enzimática era sujeita a inibição por excesso de substrato. Curiosamente, esta inibição ocorre na temperatura ambiente, sendo revertida à 37oC. Com bases nestas observações, sugerimos que a cruzipaína fosse capaz de autorregular a sua atividade enzimática durante o desenvolvimento do T. cruzi em triatomíneos. Em outra observação inédita, a análise dos perfis de pH obtidos com diferentes substratos sintéticos indicou que a cruzipaína também se comportava como uma catepsina B. Este efeito foi creditado à presença de um ácido glutâmico na posição 205 no sub-sítio S2, envolvido na interação com Arg na posição P2 de substratos peptídicos. Anos depois, a análise da estrutura cristalina do domínio catalítico da cruzipaína (convencionalmente denominada “cruzaína” pela equipe americana) confirmaria a nossa tese que a cruzipaína apresenta especificidade mista (catepsina L/B)
Polimorfismo da família cruzipaína
Os primeiros indícios que a expressão da GP57/51 (cruzipaína) era regulada durante a metaciclogênese (Dm28c) foram obtidos em estudos realizados com colaboração com a equipe de Samuel Goldenberg, da Fiocruz. Tal como ocorre durante em células mamíferas parasitadas (amastigotas>tripomastigotas), notamos que a expressão da isoforma majoritária era bem mais elevada nas formas replicativas (epimastigotes> amastigotas) do que em tripomastigotas metacíclicos. Os perfis isoelétricos mostravam heterogenidade, mas naquela época não foi possível determinar conclusivamente se a complexidade observada era apenas resultado de modificações pós-traducionais (por exemplo, diferenças no padrão de glicosilação) e/ou da existência de genes polimórficos no clone Dm28c. Pouco tempo depois, foi demonstrado que a cruzipaína era membro de uma família de genes dispostos em arranjo repetitivo. Motivada por estes achados, Ana Paula Lima sequenciou diversos cDNAs de cruzipaína derivados da biblioteca cDNA de T. cruzi Dm28c. A análise destas sequências revelou que algumas sequências apresentavam substituições pontuais de ácido-aminados. Com base em modelagem molecular, deduzimos que os bolsões de interação com substrato poderiam ser alterados em algumas isoformas. Anos depois, a análise da especificidade de substrato da cruzipaína 2 recombinante (domínio catalítico) expressa em S. cerevisae comprovaria que esta isoforma minoritária possui especificidade de substrato e propriedades catalíticas muito distintas da isoforma majoritária. Cabe ressaltar que em trabalhos posteriores, demonstramos que existem diferenças importantes no perfil de expressão destas duas isoformas, sugerindo que os diferentes membros da família cruzipaína podem ser diferencialmente regulados durante as diversas etapas do ciclo de vida do protozoário. A importância da regulação pós-traducional das isoformas de cruzipaína tornou-se ainda mais óbvia quando Ana Carolina Monteiro e colaboradores caracterizaram um potente inibidor endógeno de cisteíno proteases, a proteína “chagasina”, assim designada em homenagem ao Prof. Carlos Chagas Filho. Subsequentemente identificada em outros protozoários e até mesmo em bactérias (mas ausente em mamíferos), as proteínas da família chagasina são codificadas por sequências gênicas completamente diferente das cistatinas (i.e., inibidores de cisteíno proteases expressos em mamíferos). Estudos de RMN e análise de cristais de chagasina por difração de raios X revelaram que a chagasina possui uma estrutura tri-mensional peculiar, contendo regiões homólogas aos CDR das imunoglobulinas em seus sítios de ligação para cisteíno proteases.
Conforme destacado por Monteiro e colaboradores, a expressão da chagasina diminui nos estágios de replicação do parasita (epimastigotas/amastigotas), coincidindo com aumento de expressão da cruzipaína. Esta inversão na relação estequiométrica entre cruzipaína/chagasina sugere que a demanda nutricional associada com a divisão celular requer maximização do catabolismo protéico lisossomal, mediado em parte pela cruzipaína, por isoformas minoritárias, e pela catepsina B, préviamente descrita por Santana e colaboradores. Em contraste com o que ocorre nos epimastigotas/amastigotas, os tripomastigotas apresentam níveis relativamente elevados da chagasina, outra vez inversamente relacionados com os baixos níveis da cruzipaína. Estas observações pareciam sugerir que as funções extracelulares da cruzipaína (por exemplo, relacionadas com a invasão celular) fossem moduladas pela chagasina. Esta hipótese de trabalho foi recentemente testada usando parasitas geneticamente modificados. Os resultados comprovaram que a infectividade do tripomastigotas diminui quando a expressão da chagasina aumenta, devido à redução da atividade enzimática extracelular da cruzipaína. Em síntese, o conjunto destes estudos indica que o polimorfismo genético gerou um repertório diversificado de isoformas de cruzipaína, sendo que algumas delas apresentam funções enzimáticas peculiares. Diferencialmente sujeitas à controle pela chagasina, as isoformas de cruzipaína podem exercer funções especializadas, possivelmente favorecendo a adaptação do T. cruzi tanto no triatomíneo quanto no hospedeiro vertebrado. Ainda não foi determinado se o repertório de isoformas de cruzipaína presentes nas linhagens filogenéticas T. cruzi I e II foi preservado ou alterado durante a evolução.
O efeito antiparasitário de inibidores sintéticos da Cruzipaína
Em meados da década de 90, o desenvolvimento de inibidores seletivos para a cruzipaína tornar-se-ia uma conquista valiosa na pesquisa básica em Doença de Chagas. Estas ferramentas eram indispensáveis para estudo do papel biológico da cruzipaína, em vista das dificuldades técnicas encontradas para nocautear os múltiplos genes que codificam estas isoenzimas. Em 1992, publicamos os primeiros estudos indicando que a cruzipaína poderia ser um importante alvo terapêutico. Tivemos oportunidade de abordar esta questão utilizando as culturas primárias de cardiomiócitos que Maria Nazareth Meirelles havia padronizado na Fiocruz. Visando desenvolver novos inibidores de enzimas tipo-catepsina L, Luiz Juliano (UNIFESP) sintetizou um painel de derivados peptídicos com o grupamento diazometilcetona (reativo para a cisteína 205 de sito ativo) na extremidade C-terminal. Antes de testá-los no sistema de cultura de células, realizamos ensaios enzimáticos com a cruzipaína purificada para determinar as constantes de inibição de cada composto. Estes estudos indicaram que cruzipaína era inativada eficientemente por compostos que apresentavam resíduos aromáticos volumosos na posição P2 (por exemplo, Z-(SBz)Cys-Phe-CHN2 (31). Quando adicionados a culturas de cardiomiócitos pré-infectados, os compostos que tinham esta característica apresentaram forte efeito anti-parasitocida, com destaque para Z-(SBz)Cys-Phe-CHN2 (31). Para verificar se a cruzipaína havia sido de fato alvejada pelos referidos inibidores, tratamos as células parasitadas com inibidores peptídicos radio-iodados (substituídos por tirosina), obtivemos os lisados celulares, para em seguida tratá-los com anticorpos a-GP25. A análise dos produtos imunoprecipitados revelou a presença de inibidores radiomarcados nos imuno-complexos de cruzipaína, confirmando assim que a enzima fora alvejada nas culturas de cardiomiócitos parasitados (31). Complementando estes estudos, demonstramos que a adição de Z-(SBz)Cys-Phe-CHN2 em culturas de cardiomiócitos expostos aos tripomastigotes extracelulares inibia significativamente a invasão celular. Baseados nestes dados, sugerimos que a cruzipaína (e/ou isoformas minoritárias) fossem fatores de virulência do T. cruzi. Logo depois da publicação destes dados, Harth e colaboradores mostraram que inibidores peptídicos contendo grupamento reativo fluorometilcetona inibiam a transmissão intercelular dos parasitos em cultura de células. Infelizmente, os inibidores de cruzipaína utilizados naquela época não podiam ser empregados in vivo, por causa da toxicidade.
Conforme mencionado anteriormente, a elucidação da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da cruzaína (complexada com inibidores irreversíveis) abriu caminho para síntese de drogas mais eficazes e de baixa toxicidade. Usando inibidores irreversíveis contendo o grupamento vinilsulfona no C-terminal, Engel e colaboradores conseguiram curar camundongos infectados pelo T. cruzi. Mais recentemente, estudos pré-clinicos (em caninos e camundongos imunodeficientes) realizados com inibidores de cruzipaína de ultima geração comprovaram a potencialidade terapêutica destes fármacos.
Não obstante o progresso alcançado no desenvolvimento de fármacos capazes de inativar cruzipaína, o mecanismo de ação destas enzimas ainda não foi bem esclarecido. A primeira pista sobre a natureza dos substratos naturais da cruzipaína surgiu quando Elaine Del Nery, Luiz Juliano e colaboradores examinaram mais detalhadamente a especificidade de substrato da enzima purificada. Ao testar a protease contra um amplo painel de peptídeos sintéticos (contendo apagadores intramoleculares de fluorescência), Del Nery e colaboradores verificaram que cruzipaína hidrolisa peptídeos que apresentam as sequências flanqueadoras da bradicinina nas moléculas de cininogênios. Estas observações semearam a idéia que o parasito fosse capaz de liberar cininas, à semelhança do que ocorre com a calicreína tissular. Conforme relatarei adiante, esta hipótese foi posteriormente comprovada em diversos modelos experimentais.
Estrutura e função do Sistema Cinina
Antes de discutir o mecanismo de ativação do sistema cinina pelo T. cruzi, convêm tecer considerações sobre a estrutura multi-modular dos cininogênios. O HMW-K (626 aminoácidos) é organizado em 6 domínios (denominados D1-D6), descritos na tabela 1, sendo que apenas os 4 primeiros são compartilhados com LMW-K.
Tabela 1. Estrutura modular de HMW-K
As cininas constituem um restrito grupo de peptídeos de 9-11 aminoácidos estruturalmente relacionados com o nonapeptídeo bradicinina (BK). O primeiro grupo de cininas inclui apenas os produtos primários liberados proteoliticamente dos cininogênios: BK (nonapeptídeo) ou lisil-BK (LBK, também denominada calidina). BK/LBK agem como hormônios parácrinos, estimulando receptores transmembrana acopladas a proteína G heterotrimérica (subtipo B2) de bradicinina. Entre diversas funções biológicas importantes, a ativação do receptor constitutivo B2R induz vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e sensibilidade a dor, contração da musculatura lisa, e, conforme descrito mais adiante- maturação de células dendríticas. O efeito à distância de BK/LBK sobre B2R é controlado por enzimas as degradam, por exemplo, pela enzima conversora de angiotensina (ECA). Enquanto que o B2R é expresso constitutivamente na superfície celular (células endoteliais, músculo liso, células epiteliais, fibroblastos, células neuronais e células dendríticas), o receptor de subtipo B1 tem baixa expressão em tecidos normais. Entretanto, a expressão celular de B1R aumenta devido a ativação de MAP kinases e do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-kB), em reposta à injúria, infecção ou inflamação. É importante destacar que a especificidade farmacológica do B1R difere do B2R: os agonistas de B1R ([des-Arg9]-BK e [des-Arg]-LBK) são metabolitos gerados pela remoção proteolítica da Arg C-terminal de BK ou LBK, pela ação de cininase I (carboxipeptidase M/N). Em estados inflamatórios crônicos, a ativação de B1R induz recrutamento de leucócitos circulantes para os tecidos, contribuindo para a fibrose tecidual e angiogênese.
Mecanismo de liberação de cininas por tripomastigotas
De início a noção que a cruzipaína fosse uma “cininogenase” nos pareceu paradoxal, porque os Cininogênios (solúveis) são potentes inibidores de cisteíno proteases, devido a presença dos domínios (tipo cistatina) D2/D3. De fato, já havíamos demonstrado que cruzipaína forma complexos moleculares com HMW-K/LMW-K, resultando no bloqueio da atividade enzimática da cruzipaína. Havia ainda uma outra razão para sermos tão reticentes naquela ocasião: a incubação de HMW-K solúvel com cruzipaína resultava em uma lenta liberação de LBK, sugerindo que a atividade cininogenásica era ineficiente. Diante deste questionamento, resolvemos verificar se moléculas de HMW-K adsorvidas na superfície celular eram capazes de inibir a cruzipaína com a mesa eficiência que as formas solúveis de cininogênios. Esta hipótese foi fundamentada por achados publicados indicando que os sítios de ligação de HMW-K à célula endotelial estão presentes no domínio D3, i.e., poderiam prejudicar as interações da estrutura tipo cistatina com o sítio ativo da cruzipaína. Além disso, trabalhos publicados por outros grupos demonstraram que domínio (D5) rico em histidina (positivamente carregado) de HMW-K liga-se com grupamentos negativamente carregados de proteoglicanas sulfatadas dispostas na matriz extracelular e/ou superfície celular. Consistente com esta premissa, verificamos que a eficiência catalítica da cruzipaína aumentava drasticamente quando a enzima era incubada com heparan sulfato (HS). Além disso, a interação com HS restringiu a eficácia do efeito inibitório de HMW-K sobre a atividade peptidásica da cruzipaína. Para verificar se HMW-K disponível na superfície de células era capaz de servir de substrato para a cruzipaína, usamos células de cordão umbilical humano (HUVECs) ou células CHO-B2R (transfectadas) como indicadores da geração de cininas. As medidas de influxo de [Ca2+]i comprovaram que a cruzipaína era capaz de estimular os receptores B2R. A enzima não induziu significativo influxo de [Ca2+]i nas CHO-mock (controles). Ademais, a resposta de CHO-B2R foi bloqueada por E-64. Complementando estes estudos, repetimos esta análise usando tripomastigotas de cultivo celular (TCT) da cêpa Dm28c. Os resultados comprovaram que os parasitos eram capazes de gerar os agonistas (BK/LBK) do receptor de bradicinina de subtipo B2R através da atividade proteolítica da cruzipaína. Estes resultados sustentam a hipótese que HMW-K associado à superfície de células (por exemplo, CHO-B2R ou de HUVECs) perdem a capacidade de inibir a cruzipaína, tornando-se sensíveis ao ataque proteolítico desta cininogenase. A identificação da enzima conversora de angiotensina (ECA) como fator regulador (negativo) da ativação celular mediada pelo eixo cruzipaína>bradicinina>B2R foi uma outra observação importante feita neste trabalho. Ainda que não se tenha comprovação de que estes eventos promovem a infecção de células cardiovasculares in vivo, os estudos in vitro demonstram que o parasito pode valer-se da cruzipaína para invadir células que expressam receptores de bradicinina de subtipo B2R ou B1R (induzidas durante a inflamação). Vale a pena ressaltar que apenas os inibidores de cisteíno-proteases de natureza hidrofóbica foram capazes de inibir a invasão de HUVECs ou CHO-B2R, mas não de CHO-mock. Estes resultados sugeriram que os cininogênios (substrato da cruzipaína) são hidrolisados nas regiões de contato entre as membranas plasmáticas do parasita e da célula alvo. Estudos em andamento visam esclarecer se a atividade da cruzipaína (presumivelmente secretada na região da bolsa flagelar) é potencializada por interações com outros elementos da superfície celular.
Cooperação entre TLR2 e o Sistema Cinina na inflamação edematogênica induzida por tripomastigotas
Dando continuidade aos estudos sobre o papel da cruzipaína na fisiopatologia da doença de Chagas experimental, verificamos se os TCT eram capazes de ativar o sistema cinina in vivo. Utilizando microscopia intravital, demonstramos que os tripomastigotas aplicados topicamente no tecido da bolsa da bochecha do hamster induzem aumento de permeabilidade capilar (extravazamento de parículas de azul-dextran) através do eixo cruzipaína>BK/LBK/B2R. Ao inspecionar as veias pós-capilares, observamos que os TCT induzem marginação de leucócitos em poucos minutos, precedendo o início do extravasmanto de plasma. Cabe ressaltar que a aplicação tópica de baixas concentrações de cruzipaína não induziu significativo extravasamento de plasma. Entretanto, a adição de uma fonte exógena de HMW-K juntamente com a cruzipaína produziu forte aumento de permeabilidade capilar pela via cruzipaína/B2R-dependente. Com base nestas observações, resolvemos explorar a possibilidade que o efeito da cruzipaína é condicionado pelo influxo de plasma (fonte de HMW-K/LMW-K) para o tecido extravascular. Em outras palavras, deduzimos que os TCT induziam, ainda que discretamente, o influxo de proteínas plasmáticas (contendo cininogênios) por uma outra via de ativação, até então indefinida. Esta hipótese nos pareceu plausível porque a injeção de epimastigotas (que expressam quantidades abundantes de cruzipaína) em dose igual ao inoculo de tripomastigota, também não induzia significativo extravasamento de plasma no tecido da bochecha do hamster, nem tampouco induzia edema de pata em camundongos, mesmo após tratamento dos animais com captopril (inibidor da ECA). Nesta época, Ricardo Gazzinelli, Igor Almeida e colaboradores, haviam já demonstrado que TCT expressam altos níveis de uma ancora lipídica pró-inflamatória (tGPI-mucin), caracterizada como ligante de TLR2. Cabe ressaltar que os epimastigotas expressam baixas quantidades deste ligante. De fato, a explicação do mecanismo de ação da cruzipaína surgiu quando examinamos a contribuição de ligantes de TLRs no mecanismo de ativação de cininas (eixo cruzipaína>BK/LBK>B2R), usando como indicador biológico a resposta inflamatória edematogênica induzida por TCT (Dm28c) em camundongos selvagens e deficientes de TLR2, TLR4 e B2R. Além de demonstrar que a ativação de neutrófilos via TLR2 promove acumulo de cininogênios no tecido extravascular, mostramos que estes eventos influenciam (i) a produção de IL-12 por células dendríticas recrutadas para os linfonododrenantes e (ii) o perfil de resposta TH anti-T. cruzi. Com base nestes resultados, concluímos que a inflamação induzida pela cooperação entre TLR2/B2R estimula respostas TH1 o modelo de infecção subcutânea. Os trabalhos que demonstram a importância da ativação de células dendríticas pela bradicinina (previamente definida como um sinal endógeno de maturação) serão descritos no próximo capitulo. Por enquanto, os leitores interessados podem se beneficiar da leitura dos artigos originais recentemente publicados por nossa equipe.