Clássica
Sistemática clássica
Cleber Galvão
Laboratório Nacional e Internacional de Referência em Taxonomia de Triatomíneos, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: galvao@ioc.fiocruz.br
Os membros da subfamília Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) (Figura 1), apresentam grande interesse porque são hematófagos e transmissores do Trypanosoma cruzi (Chagas 1909), o agente etiológico da doença de Chagas, Apenas alguns outros membros da ordem Hemiptera, das famílias Cimicidae (percevejos-de-cama), Polyctenidae (ectoparasitos de morcegos), e alguns membros da tribo Cleradini, também sugam sangue. Como importantes vetores, os triatomíneos têm atraído permanente atenção, portanto, vários aspectos de sua biologia, ecologia, biogeografia e evolução vêm sendo estudados há décadas. Desde a primeira descrição no século XVIII, até o presente, a classificação desses insetos se fez predominantemente através do conceito morfológico tradicional, e a subfamília foi considerada um grupo monofilético. Nos anos 80, surgiu uma nova proposta, apoiada em aspectos ecológicos e biogeográficos sugerindo a origem polifilética da subfamília. Recentemente análises cladísticas usando o DNA trouxeram de volta a hipótese da origem monofilética, quebrando o paradigma da origem polifilética. No presente texto sumarizamos o conhecimento atual da sistemática desses vetores, incluindo um breve histórico dos mais relevantes estudos da sistemática da subfamília.
Figura 1: Morfologia geral externa – Triatominae.
A primeira grande subdivisão dos animais é o filo, que se subdivide em classes, estas se subdividem em ordens, estas em famílias, as famílias em gêneros, e estes em espécies. Existem ainda diversas divisões intermediárias como, por exemplo, subfamílias e tribos, No filo Arthropoda estão incluídos, entre outros, os insetos. As principais características dos artrópodes são pernas articuladas e a presença de um exoesqueleto (esqueleto externo duro e resistente, formando uma espécie de carapaça que protege e sustenta os órgãos internos),
Dentro do filo Arthropoda é na classe Insecta que estão incluídos todos os insetos que se agrupam em diversas ordens, dentre elas a ordem Hemiptera. Nesta ordem, estão agrupados os insetos conhecidos vulgarmente como percevejos. Uma das principais características dos insetos que integram esta ordem é a estrutura das asas anteriores, na maioria dos hemípteros, a parte basal da asa é espessada e coriácea e a apical, membranosa; este tipo de asa é chamada de hemiélitro, e daí deriva o nome da ordem (Hemi=metade, ptera=asa). As peças bucais dos hemípteros são do tipo picador-sugador, o aparelho bucal é chamado de lábio e origina-se na parte anterior da cabeça. A maioria das espécies é terrestre, porém, algumas são aquáticas; muitas sugam plantas, outras são predadoras de outros insetos (ou entomófagas) e algumas hematófagas,
Das mais de 40 famílias de hemípteros apenas duas têm interesse na medicina humana, devido ao hábito hematofágico de suas espécies: Cimicidae (percevejos-de-cama) e Reduviidae. O número de subfamílias aceitas dentro de Reduviidae varia de 21 a 29, de acordo com diferentes especialistas. Apenas uma subfamília (Triatominae) realiza hematofagia, as demais subfamílias são compostas por insetos predadores.
O primeiro relato sobre a aparência e os hábitos de um triatomíneo data de 1590 e foi feito por Reginaldo de Lizárraga, que em viagens de inspeção a conventos do Peru e Chile, notou a presença de grandes insetos hematófagos que atacavam durante a noite. Diversos outros viajantes e naturalistas também citaram a presença desses insetos na América do Sul, um dos mais célebres relatos deve-se a Charles Darwin, que durante sua viagem pela América do Sul a bordo do H.M.S, Beagle, em 1835, registrou em seu diário:
“When placed on a table, and though surrounded by people, if a finger was presented, the bold insect would immediately protrude its sucker, make a charge, and if allowed, draw blood, No pain was caused by the wound, It was curious to watch its body during the act of sucking, as in less than ten minutes it changed from being as flat as a wafer to a globular form…”
A publicação do Systema Naturae por Carolus Linnaeus em 1758 já incluía a criação da ordem Hemiptera, porém, a essa época o agrupamento desses insetos em uma subfamília ainda não havia sido proposto. Os estudos taxonômicos dos triatomíneos começaram com as publicações: Mémoire pour servir à l´histoire des insectes por (De Geer,1773) onde a primeira espécie foi descrita como Cimex rubrofasciatus (Figura 2), sessenta anos mais tarde, Laporte (1833) a designou como espécie-tipo do gênero Triatoma passando a ser chamada Triatoma rubrofasciata. Em 1811, Latreille publicou Insectes de l´Amérique équinoxiale descrevendo Reduvius dimidiatus e Reduvius geniculatus e Stål publicou em 1859 a Monographie der Gattung Conorhinus und Verwandten, no Berliner Entomologisches Zeitschrift. Em 1873, Walker publicou o Catalogue of the Species of Hemiptera Heteroptera in the Collection of the British Museum. Posteriormente, Berg, Uhler, Champion, Breddin e Distant, descreveram novas espécies ampliando consideravelmente o número, que em 1907 já chegava a 57, das quais, 32 são hoje consideradas válidas.
Figura 2: Male of Triatoma rubrofasciata.
Durante mais de um século, desde a primeira descrição de De Geer, os triatomíneos foram estudados apenas de um ponto de vista meramente descritivo, porém, a partir de 1909, com a descoberta de Carlos Chagas, e devido a óbvia importância médico sanitária adquirida, iniciaram-se estudos sobre a forma clínica da doença, sobre o protozoário e seus hospedeiros vertebrados e sobre a biologia e mecanismos de transmissão dos vetores (Figura 3). Com relação à taxonomia dos vetores, um dos principais responsáveis pelo avanço nessa nova fase foi Arthur Neiva, que a partir de 1911, descreveu diversas espécies culminando com a publicação de sua tese: Revisão do gênero Triatoma Lap. Monografias importantes foram publicadas posteriormente por Pinto (1925) e Del Ponte (1930), além de outros trabalhos extensos publicados por Neiva & Lent (1936, 1941), por Usinger (1944) por Abalos & Wygodzinsky (1951) e Ryckman (1962), culminando com a revisão de Lent e Wygodzinsky (1979).
Figura 3: Panstrongylus megistus.
A utilização da morfometria em Triatominae surgiu na década de 90 como uma tentativa de refinamento do estudo taxonômico convencional, posteriormente um novo ramo desse método, a morfometria geométrica, também começou a ser utilizada nos estudos dos triatomíneos, avançando além do alcance da morfometria tradicional. A primeira tentativa de utilizar caracteres não morfológicos para solucionar questões taxonômicas se deve a Actis e colaboradores (1964,1965) que utilizaram a eletroforese de proteínas da hemolinfa para comparar espécies do complexo T. sordida, estudos similares, porém mais abrangentes, foram publicados três anos mais tarde por Brodie e Ryckman. Desde então, diversos estudos usando análises genéticas para caracterização específica ou como ferramenta taxonômica foram publicados. Mais recentemente Carcavallo et al. (2000) e Galvão et al (2003) sumarizaram os trabalhos taxonômicos subsequentes a revisão de Lent & Wygodzinsky (1979), enquanto Schofield & Galvão (2009) reorganizaram o gênero Triatoma em três grupos e oito complexos. Atualmente a subfamília está composta de seis tribos, 18 gêneros e 152 espécies.
A hipótese que os triatomíneos tenham evoluído a partir de ancestrais predadores (não triatomíneos) é atualmente aceita, entretanto, se desconhece qual(is) é(são) o(s) grupo(s) predador(es) que deu(ram) origem aos triatomíneos, esta questão é dificultada pela escassez de registro fóssil, restrito a apenas duas espécies descritas por Ponair (2005, 2013). Conhecer os caminhos evolutivos percorridos durante o processo de adaptação a sucção de sangue não é tarefa fácil, as diferentes propostas existentes atualmente são motivos de polêmica e discussão. O consenso sobre a origem dos triatomíneos está longe de ser alcançado, novas análises cladísticas com amostras mais significativas e combinando caracteres morfológicos e moleculares são necessárias para se chegar a uma conclusão segura sobre a questão,
A revisão taxonômica de Lent e Wygodzinsky (1979) se tornou um divisor de águas facilitando o trabalho dos taxonomistas, sendo a classificação atual da subfamília baseada nesta publicação. Embora não tenha sido aplicada formalmente a teoria proposta por Willi Hennig, nela foram lançados os primeiros postulados sobre o relacionamento filogenético da subfamília e sua relação com possíveis grupos irmãos, defendendo claramente a origem monofilética proposta inicialmente por Usinger (1944). De acordo com Lent e Wygodzinsky (1979) a origem monofilética dos triatomíneos poderia ser suportada por três possíveis autapomorfias: a) o hábito hematofágico, b) a presença de uma membrana flexível conectando segundo e terceiro segmentos rostrais, facilitando a sucção, e c) perda das glândulas de cheiro abdominais nas ninfas. Posteriormente, a hipótese monofilética foi apoiada posteriormente pelos estudos de Clayton (1990), Schuh & Slater (1995), Gaunt & Miles (2000) e Hypsa et al. (2002). Embora reconhecida por aqueles autores como uma subfamília monofilética de Reduviidae adaptada a hematofagia, várias questões sobre a origem e evolução desses vetores permanecem desconhecidas. Em 1988, Schofield propôs um conceito de origem polifilética onde a fauna asiática atual seria derivada de, pelo menos duas linhagens independentes de grupos ancestrais de Reduviídeos. A primeira linhagem seria composta por espécies de Triatoma supostamente descendentes de T. rubrofasciata após sua introdução no Velho Mundo. A outra linhagem, representada pelo gênero Linshcosteus, seria supostamente autóctone da India. Essa hipótese foi suportada por Gorla e colaboradores (1997) por meio de análises morfométricas, onde as espécies de Linshcosteus estariam dissociadas das espécies de Triatoma do Velho Mundo. Por outro lado, análises cladísticas moleculares de 57 espécies realizadas por Hypsa e colaboradores (2002) mostraram o gênero Linshcosteus e Triatoma rubrofasciata como grupos irmãos, com o clado Linshcosteus–T. rubrofasciata enraizado em Triatomini, suportando a origem monofilética da subfamília. Segundo Schaefer a questão mais importante sobre o relacionamento filogenético dos triatomíneos pode ser dividida em duas partes: 1) Triatominae é verdadeiramente uma subfamília independente? 2) se a subfamília Triatominae é independente, com quais outras subfamílias de Reduviidae ela estaria relacionada? Tentando solucionar essa questão, diversos cientistas têm usado dados moleculares para inferir relacionamentos filogenéticos, Infelizmente, a maioria desses trabalhos foi baseada em um número limitado de táxons, impossibilitando responder a essas questões com segurança. Assim como não devemos usar um único caráter morfológico para definir ou identificar uma espécie, é prudente não fazê-lo também com uma única sequência de DNA. É importante ressaltar também, que análises cladísticas precisam sempre de uma hipótese a priori (a ser testada), e quem fornece essa hipótese é geralmente a taxonomia convencional. Outro aspecto interessante da taxonomia convencional é seu aspecto utilitarista, que torna seus resultados mais facilmente compreendidos para uma audiência não-acadêmica (p, ex, agentes de controle de vetores). A taxonomia convencional está também, “protegida” pelo ICZN, mas a Sistemática Filogenética já tem seu próprio código de nomenclatura, o PhyloCode, uma alternativa para o sistema de nomenclatura baseado em categorias dos códigos convencionais. Embora ainda não esteja em operação formal, o PhyloCode está disponível na internet, com interesse crescente entre os cientistas o progresso da Sistemática Filogenética parece ser irreversível.
Sistemática Molecular
Fernando Monteiro
Laboratório de Doenças Parasitárias, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: fam@ioc.fiocruz.br
Análises moleculares vêm revolucionando a biologia; entre suas muitas aplicações destacamos o desenvolvimento de marcadores moleculares para a distinção de entidades biológicas (populações, espécies, etc.) e avaliação de seu relacionamento sistemático e evolutivo.
Programas de controle vetorial já se beneficiam de conhecimento gerado por estudos moleculares, Entre as contribuições mais relevantes podemos citar a identificação e caracterização de populações de vetores introduzidas, tais como R. prolixus na América Central ou T. infestans em países do Cone Sul; definição precisa de alvos de intervenções de controle, incluindo R. prolixus como espécie válida e separada de R. robustus e as formas cromáticas de T. brasiliensis constituindo espécies distintas descrito por Monteiro e colaboradores. Respostas às perguntas mais fundamentais frequentemente encontram-se no âmbito da sistemática ‘fina’ como aquela que lida com a variação intraespecífica, contudo, a avaliação da variabilidade interespecífica e relacionamentos filogenéticos são importantes em muitos casos, pois permitem extrapolações mais amplas sobre grupos epidemiologicamente relevantes, como revisto por Schaefer.
Apresentamos aqui uma revisão sobre o uso de marcadores moleculares em triatomíneos. Além disso, comentamos sobre a aplicabilidade, vantagens e desvantagens das principais técnicas moleculares (Tabelas 1 e Tabela 2), fornecemos sugestões para estudos futuros e destacamos questões importantes a serem consideradas durante o planejamento de projetos futuros e seu desenho experimental (Tabela 3).
Nós enfatizamos a idéia de que a identificação correta dos insetos é um passo crucial para a confiabilidade na compreensão da biologia do vetor. Investigações ecológicas, comportamentais, fisiológicas, epidemiológicas ou evolutivas, assim como o planejamento e monitoramento de intervenções de controle, dependem necessariamente de julgamentos taxonômicos acurados. Ao mesmo tempo, a análise de dados moleculares ilumina questões mais básicas sobre parentesco, evolução e tendências adaptativas dos vetores. Discutimos o uso de diferentes técnicas para a análise de material genético (citogenética, métodos baseados em PCR e produtos gênicos (aloenzimas) no estudo de populações, espécies, gêneros e tribos dos Triatominae. Este ensaio se concentra nos métodos que têm gerado a maior riqueza de informações e, em especial, naqueles que tem produzido conhecimentos chave para o desenho de estratégias racionais de controle da doença de Chagas.
Diferentes abordagens moleculares apoiadas em boas estratégias de amostragem e escolha adequada de marcadores podem ser empregadas na elucidação de problemas de biogeografia, comportamento, taxonomia, evolução e estrutura populacional de triatomíneos. Apresentamos aqui uma apreciação geral dos resultados obtidos até agora nestes campos.
Também, tentamos estimular a investigação na área apontando novos caminhos ao mesmo tempo em que alertamos para os requisitos e cuidados a serem observados na elaboração dos projetos. Com resultados de qualidade, elevada os estudos de genética molecular continuarão a contribuir para a elaboração de programas mais eficazes de vigilância e controle dos vetores da doença de Chagas.
Citogenética
Triatomíneos têm cromossomos holocêntricos, geralmente com um complemento diplóide de 2n=20A+XX/XY (20 autossomas mais XX♀ e XY♂), Cariótipos com 18A e 22A são raros. Machos de espécies de Triatoma das Américas Central e do Norte geralmente apresentam mecanismo sexual X1X2Y, enquanto as espécies sul-americanas tipicamente apresentam XY, Panstrongylus e Eratyrus também apresentam X1X2Y. Todos os Rhodniini têm um complemento diplóide 2n=20A+XX/XY. Técnicas citogenéticas especiais, como C-banding e análise detalhada de regiões heterocromáticas, ou o estudo do comportamento meiótico dos cromossomos masculinos, têm sido usados para complementar a caracterização morfológica de Triatominae. Aplicações destes métodos vão desde a identificação de espécies similares e detecção de variabilidade intraespecífica à investigação de relações evolutivas em diferentes níveis de divergência, como revisto por Dujardin.
Métodos com base no DNA
O uso de técnicas de DNA para o estudo de triatomíneos tem uma história curta, embora bastante dinâmica. Estudos moleculares geraram novas perspectivas dentro das tendências evolutivas da subfamília, com projetos em níveis que vão desde inter-tribos até intraespecíficos. Tanto polimorfismos em sequências gênicas nucleares quanto mitocondriais têm sido estudados. Muitos resultados têm sido usados para refinar e melhorar estratégias de controle na América Latina, e certamente provar-se-ão cruciais também no estudo de vetores secundários. Muitas técnicas baseadas no DNA têm sido aplicadas aos triatomíneos. Estas incluem a amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD), análise do polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP), sequenciamento de DNA de fragmentos de genes nucleares e mitocondrias e caracterização de loci de microsatélites.
DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD)
A amplificação de DNA polimórfico com oligonucleotídeos aleatórios (Figura 1) tem sido usada para investigar a variabilidade genética em vários insetos de importância médica. Em triatomíneos, a diversidade entre populações de T. infestans e T. sordida foi avaliada por Carlier e colaboradores. Os padrões de bandas claramente separaram as espécies e discriminaram populações silvestres e domésticas de T. infestans. Noutro estudo realizado por Noireau e coloboradores sobre o T. infestans boliviano, perfís de RAPD separaram dois agrupamentos principais (Andes e Chaco) e, dentro de cada clado, populações silvestres e domésticas, García e colaboradores desenvolveram perfis de RAPD diagnósticos para os pares R. prolixus-robustus e R. neglectus-nasutus. Populações hondurenhas e colombianas de R. prolixus apresentavam padrões de RAPD diagnósticos. A reduzida variabilidade entre estes insetos na América Central sugere dispersão antrópica recente de uma população de origem sul-americana, encorajando o pensamento de que a sua erradicação é exequível nesta região.
Figura 1
Embora a resolução da análise por RAPD seja muito maior do que a da eletroforese de aloenzimas na detecção da variabilidade intraespecífica, o uso de oligos aleatórios requer extremo cuidado para minimizar a contaminação e os problemas com a reprodutibilidade (Figura 2). Outro problema sério com RAPDs é que há pouca garantia de homologia entre bandas de mesmo tamanho porque os oligos anelam-se ao acaso. Até as condições específicas empregadas na preparação das amostras e da PCR podem também afetar os resultados, reduzindo a confiabilidade e a reprodutibilidade. Finalmente, como os marcadores de RAPD são dominantes (Figura 3), não há como determinar se uma única banda no gel corresponde a um indivíduo homozigoto ou heterozigoto. Isto afasta a possibilidade do uso destes marcadores em estudos de genética de populações porque a conformidade às expectativas do equilíbrio de Hardy-Weinberg não pode ser testada.
Figura 2
Figura 3
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento de fragmentos de genes (Figura 4) permite a avaliação direta de polimorfismos de DNA, fornecendo o melhor tipo de dado para inferências filogenéticas e determinação de relações de parentesco entre indivíduos e populações. Diferentes segmentos de DNA mitocondrial (mt) e nuclear evoluem a taxas diferentes. Regiões de evolução rápida são adequadas para o estudo de organismos proximamente relacionados, enquanto regiões mais conservadas são mais apropriadas para a comparação entre táxons mais divergentes.
Figura 4
Genes mitocondriais
Mitocôndrias são organelas citoplasmáticas de células eucarióticas; estão envolvidas em processes fisiológicos e patológicos chave. Em metazoários, cada mitocôndria possui uma única molécula de DNA circular, de 15-20 Kb, contendo genes que codificam para 2 rRNAs, 22 tRNAs e 13 mRNAs responsáveis pela síntese de proteínas da respiração celular. Essa mesma composição gênica é encontrada no único genoma mitocondrial de triatomíneo já sequenciado (o de T, dimidiata). Quando comparado com o de outros insetos, o genoma mitocondrial de 17019 pares de bases de T. dimidata (Figura 5) apresenta menor composição de adenina + timina (69,5% A+T), como revisto por Dotson e Beard.
Figura 5
A molécula de mtDNA, presente em cópias múltiplas (102-140) por célula, é de herança maternal, replica sem recombinação e evolui mais rapidamente que o genoma nuclear. Taxas altas de substituição são devidas, em parte, a mecanismos de reparo deficientes durante a replicação.
Genes mitocondriais são amplamente usados em estudos de genética populacional e filogenia. Variabilidades presentes em genes mitocondriais de evolução rápida são úteis na investigação de táxons que divergiram em tempos geológicos mais recentes. Em níveis de divergência mais antigos, sítios variáveis estão sujeitos ao acúmulo de substituições múltiplas (especialmente de mutações do tipo transição nas terceiras posições dos códons), levando, portanto à saturação. Saturação apaga o sinal filogenético e é uma das maiores causas de homoplasia. Outros cuidados a serem tomados com respeito à interpretação de resultados de mtDNA no estudo de táxons proximamente relacionados incluem a possibilidade de ocorrência de introgressão em zonas híbridas (geralmente detectável com o emprego de dados complementares de loci nucleares) e a retenção de polimorfismos ancestrais. Por outro lado, o sequenciamento direto de genes mitocondriais é mais fácil do que o de genes nucleares (que podem requerer clonagem), e o alinhamento das sequências não oferece problema.
Em 1999, Monteiro e colaboradores reportaram o primeiro estudo de polimorfismos de sequências de mtDNA (gene citocromo b [cyt b]) entre populações do triatomíneo vetor, T. infestans. Os resultados revelaram que T. melanosoma e as formas silvestres melânicas de T. infestans são apenas variações fenotípicas da mesma espécie. Diferenças pequenas, porém consistentes, foram achadas entre populações bolivianas e aquelas da Argentina e do Brasil. Na Bolívia, todos os insetos Andinos apresentaram o mesmo haplótipo, enquanto os melânicos da região das planícies do Chaco apresentaram haplótipos ligeiramente divergentes. Essas formas melânicas diferem fenotipica e ecologicamente (são escuros e ocupam ocos de árvores no Chaco) dos T. infestans Andinos. Aloenzimas, citogenética, intercruzamentos, RAPD e mtDNA corroboraram a idéia de uma única espécie. Estudo recente com base no gene mitocondrial cyt b que incluiu todas as variações cromáticas de T. brasiliensis (Figura 6) mostrou que as formas juazeiro e melanica merecem status específico. Estas duas formas cromáticas foram recentemente elevadas à categoria específica por Costa e colaboradores. T. b. brasiliensis e T. b. macromelasoma (muito diferentes de juazeiro e melanica) parecem também representar linhagens evolutivas distintas. Entretanto, devido à distância entre elas não ser grande como a das outras populações, uma decisão taxonômica robusta deve aguardar análises futuras.
Figura 6
Análises de sequências de mtDNA revelaram que populações de T. dimidiata da península de Yucatan são muito divergentes (possivelmente espécies crípticas) e que a dispersão natural da espécie provavelmente seguiu uma rota norte-sul do sul do México passando pela América Central e chegando a Colômbia. Populações Equadorianas, entretanto, provavelmente derivam recentemente de populações de Honduras/Guatemala, apoiando a hipótese de introdução artificial da espécie no Equador e Peru propostas pelos grupos de Marcilla e de Abad-Franch.
De maneira semelhante, várias populações de R. prolixus (Venezuela, Colômbia, Honduras, Guatemala e Brasil) são virtualmente idênticas com base em haplótipos de cyt b, indicando dispersão artificial recente de formas sinantrópicas. Esta conclusão é também sustentada por análises métricas e por RAPD. Por outro lado, como descrito por Monteiro e colaboradores, altos níveis de estruturação foram encontrados entre várias populações de R. robustus, sugerindo que este táxon contém um complexo de pelo menos quatro espécies crípticas (Figura 7).
Figura 7
Em estudo de sequências do gene mt cyt b dados de cinco populações de R. ecuadoriensis (Figura 8) (quatro do Equador e uma do Peru). Abad-Franch e colaboradores descobriram que insetos do Peru apresentavam um haplótipo marcadamente diferente, enquanto todas as sequências do Equador (nove haplótipos) eram similares. Os resultados sugerem que os dois clados representam filogrupos discretos (ou mesmo espécies incipientes), e indicam que programas de controle podem atacá-las independentemente.
Figura 8
Dados de sequências mitocondriais têm sido usados para resolver questões taxonômicas. O status específico de muitos táxons problemáticos foi confirmado como com R. prolixus, robustus, nasutus e neglectus, enquanto espécies reconhecidas revelaram-se apenas variantes cromáticos, como T. infestans e T. melanosoma. Em muitos casos, as análises revelaram que uma única espécie era de fato composta de mais de um táxon críptico, como T. dimidiata, T. brasiliensis, R. robustus, ou R. ecuadoriensis. Em recente análise de sequências de mt cyt b, foi mostrado que R. pallescens é uma espécie muito variável, com quatro haplótipos moderadamente divergentes detectados em uma amostragem pequena. A espécie próxima R. colombiensis apresentou um haplótipo que encontrava-se dentro da variação intraespecífica de pallescens, sugerindo ou co-especificidade (colombiensis possivelmente representando uma raça ou subespécie) ou divergência muito recente. Um caso interessante de sequenciamento de um único espécime (identificado como R. robustus e pertencendo a uma população frequentemente coletada de palmeiras na Amazônia Equadoriana revelou um haplótipo de cyt b singular e nunca encontrado em Rhodnius. Através de análise filogenética, Abad-Franch mostrou que esse espécime representa o táxon mais basal da linhagem que inclui R. prolixus, neglectus, o complexo robustus e Psammolestes. Se estudos futuros confirmarem esses resultados preliminares, uma nova espécie de triatomíneo terá sido descoberta através de análise de DNA.
O uso de mtDNA na investigação de questões sistemáticas e filogenéticas em triatomíneos começou na década de 90. Foi mostrado por Stothard e colaboradores que os três gêneros principais (Rhodnius, Triatoma e Panstrongylus) são bem separados. Dois clados principais (Rhodniini e Triatomini) eram evidentes, mas distâncias genéticas foram maiores entre R. pictipes e R. prolixus do que entre Panstrongylus e Triatoma.
A filogenia de 11 espécies do complexo infestans mais outras quarto foi explorada com base nos genes mitocondriais 12S, 16S e citocromo oxidase I, García e colaboradores confirmaram a proximidade evolutiva de T, infestans e T, platensis, sendo também encontrada evidência sugerindo introgressão de mtDNA entre elas, T. circummaculata e T. rubrovaria ficaram dentro do complexo infestans, enquanto P. megistus agrupou-se com espécies norte-americanas, T. sordida ficou próxima a T. matogrossensis e distante de T. guasayana.
Os genes mitocondriais 16S rRNA e cyt b foram usados por Lyman e colaboradores. A tribo Rhodniini se mostrou bem diferente da tribo Triatomini com profunda separação entre os ramos que as conectam na árvore filogenética. Espécies de Triatomini puderam ser ainda separadas em um grupo das Américas Central e do Norte e outro contendo as espécies da América do Sul. O posicionamento de P. megistus e Dipetalogaster maxima foi incerto, mas ambos ficaram dentro de Triatoma, o que é uma indicação da natureza parafilética deste gênero.
Monteiro e colaboradores estudaram o relacionamento entre várias espécies de Rhodniini, incluindo os dois gêneros desta tribo: Rhodnius and Psammolestes. Resultados confirmaram a parafilia de Rhodnius (Figura 9), com Psammolestes aparecendo mais próximo do clado prolixus do que com o clado pictipes. Análise de parcimônia de 1429bp (incluindo fragmentos dos genes mitocondriais 16S rRNA e cyt b além da região variável D2 do gene ribossomal nuclear 28S) gerou dois clados principais: ((brethesi-pictipes) (ecuadoriensis-pallescens) e (Ps, tertius (neivai (domesticus (nasutus (neglectus-prolixus) (robustus-prolixus).
Figura 9
Hypša e colaboradores combinaram diferentes fragmentos de DNA (predominantemente 16S mitocondrial) para construir uma filogenia de 57 espécies de Triatominae representando nove gêneros e incluindo Linshcosteus do Velho Mundo. A demarcada separação entre Triatomini e Rhodniini mais uma vez se confirmou. A maior parte das sub-divisões genéricas reconhecidas atualmente não apareceram como grupos monofiléticos, Panstrongylus, Dipetalogaster, Mepraia e Linshcosteus, todas apareceram como grupos irmãos de diferentes espécies de “Triatoma”. A parafilia de Rhodnius com respeito à Psammolestes também foi confirmada. Vários rearranjos taxonômicos e sistemáticos foram propostos, mas algumas questões importantes (como a aparente não-monofilia de Panstrongylus) não foram discutidas.
Entretanto, o achado mais importante deste trabalho, embora não tão bem sustentado foi a indicação de que a sub-família Triatominae é monofilética. A observação de que o gênero do Velho Mundo Linshcosteus se agrupa com Triatomini (com T. rubrofasciata como seu grupo irmão) claramente exclui a possibilidade de origem separada e independente para Linshcosteus. Uma discussão elucidativa sobre a questão de uma origem mono ou polifilética dos Triatominae foi elaborada por Schaefer.
Em trabalho recente, Gaunt e Miles usaram sequências do gene mitocondrial COI e dados de aminoácidos para calibrar um relógio molecular mitocondrial para várias ordens de insetos, incluindo Hemíptera. Seus resultados sugerem que a separação evolutiva entre Triatomini e Rhodniini aconteceu há 93 milhões de anos, coincidindo com o início da separação da América do Sul e da África durante o Cetáceo. A natureza parafilética de Triatoma ficou aparente, já que tanto Eratyrus quanto Panstrongylus se agruparam com representantes daquele gênero.
Genes nucleares
Genes nucleares são geralmente mais conservados que genes mitocôndrias. São, portanto, mais indicados para análises da diversidade e relacionamentos acima do nível de espécie.
Entretanto, espaçadores de RNA ribossomal como os espaçadores internos transcritos (ITSs) podem ser informativos para análises populacionais. Estes marcadores também têm sido empregados em estudos taxonômicos e evolutivos em Triatominae. Os maiores problemas referentes ao uso de ITS em sistemática são relacionados ao alinhamento das sequências e a variabilidade intragenômica.
Além da análise combinada de fragmentos mitocondriais com a região variável D2 do 28S rRNA mencionada acima, o segundo espaçador interno transcrito (ITS-2) do rDNA nuclear foi recentemente testado como marcador molecular para populações, espécies e relacionamento filogenético em Triatominae. Estas comparações incluíram predominantemente espécies Mesoamericanas de Triatoma pertencentes ao complexo phyllosoma, outros Triatoma da América do Sul e várias espécies de Panstrongylus; muitas populações de T, infestans e alguns Rhodniini também foram analisadas por Marcilla e colaboradores.
Análise filogenética de sequências de ITS-2 (Figura 10) realizada por Marcilla e colaboradores corroborou achados importantes baseados em DNA mitocondrial por revelar dois clados majoritários dentro de Triatomini, um composto de espécies das Américas Central e do Norte (incluindo T. dimidiata, três espécies do complexo phyllosoma, T, barberi e D, maxima) e o segundo contendo espécies Sul-americanas (T. infestans, T. sordida, T. brasiliensis e P. megistus). Confirmam também a parafilia de Rhodnius mostrando que P. tertius é mais proximamente relacionado à R. prolixus que este é de R. stali. Esta análise foi posteriormente ampliada e incluiu varias espécies de Panstrongylus. Estes estudos mostraram que alguns rearranjos taxonômicos podem ser necessários no complexo phyllosoma e no gênero Panstrongylus. Por exemplo, T. picturata e T. longipennis apresentaram sequências idênticas, e o grau de variabilidade dentro de T. dimidiata foi maior que o encontrado para o resto das espécies de phyllosoma. Além disso, P. lignarius (considerado silvestre) e P. herreri (vetor importante no norte do Peru) apresentaram sequências de ITS-2 idênticas apesar da amostragem geográfica ampla. Estas espécies foram recentemente sinonimizadas por Galvão e colaboradores, procedimento que pode ser apropriado também para P. chinai e P. howardi, que são provavelmente variações cromáticas da mesma espécie. A posição inesperada de P. rufotuberculatus como espécie irmã do grupo dimidiata-phyllosoma, com T. barberi – D. maxima ocupando o ramo externo imediato, foi interpretado como forte indicação da não-monofilia de Panstrongylus.
Figura 10
A total identidade das sequências de espécimes de T. dimidiata do Equador e de Honduras sugere que o primeiro derivou recentemente de uma população meso-americana provavelmente introduzida no oeste do Equador num passado recente. Conclusões similares com respeito à intervenção humana no transporte passivo de populações de insetos sinantrópicos foram tiradas de análises de variação em sequências de ITS-2 entre populações geográficas de T. infestans realizadas por Marcilla e colaboradores.
A análise da subunidade 18S do rDNA nuclear realizada por Bargues e colaboradores mostrou ser esta muito mais conservada do que o ITS-2 ou mesmo aos genes mitocondrias; em triatomíneos, a taxa de substituição chega a 1,8% de divergência por 100 milhões de anos, o que é 55 vezes mais lento do que ITS-2. Essas taxas de substituição foram usadas para calcular o tempo de divergência entre varias espécies de triatomíneos; de acordo com esse relógio molecular de 18S rDNA, a divergência entre Triatomini e Rhodniini daria uma estimativa de 48,9-64,4 milhões de anos atrás (Palaeocene-Eocene). Estimativas de divergência entre espécies meso e sul-americanas de Triatomini caem entre 22,8 e 31,9 milhões de anos atrás (para 18S) e entre 19,5 to 34,1 milhões de anos atrás (para ITS-2), muito antes do Istimo do Panamá ligar as Américas do Norte e do Sul no Plioceno (3 milhões de anos).
Microssatélites
Microssatélites (Figura 11) são séries de sequências repetitivas curtas [como (GT)n ou (AT)n dentro do DNA nuclear (Figura 12); são altamente polimórficos, neutros, e exibem herança mendeliana e co-dominância. Microssatélites tornaram-se as ferramentas de escolha em genética de populações quando outros marcadores não apresentam um grau adequado de polimorfismo. Harry e colaboradores estudaram populações silváticas de R. pallescens de palmeiras Attalea; e encontraram que seis de cada 10 microssatélites avaliados estavam presentes em frequências não diferentes das esperadas pelo equilíbrio de H-W, sugerindo panmixia dentre as populações de palmeiras na área. Amplicons também foram obtidos usando DNA molde de R. ecuadoriensis e R. prolixus. Mais recentemente, Anderson e colaboradores identificaram e caracterizaram oito loci de microssatélites de populações de T. dimidiata do México, Guatemala e Honduras, e García e colaboradores caracterizaram 10 loci em T. infestans.
Figura 11
Figura 12
Eletroforese de Aloenzimas
A análise de propriedades eletroforéticas de aloenzimas (Figura 13) (enzimas com a mesma função, mas com padrões de migração eletroforéticos distintos codificados por alelos do mesmo locus (Figura 14) tem sido extensivamente empregada no estudo dos Triatominae. Esta metodologia representou, por décadas a primeira escolha para examinar a taxonomia e os relacionamentos evolutivos de inúmeros organismos, incluindo insetos. Análises no nível intraespecífico possibilitam (1) a avaliação do grau de variabilidade genética dentro de determinada espécie ou população (dado pelo número esperado de indivíduos heterozigotos nos loci analisados – He), (2) a detecção de desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg intrapopulacional (através da observação do excesso ou déficit de heterozigotos – FIS), e (3) a estimação de níveis de estruturação genética (medida como a diferenciação entre populações com base no componente interpopulacional da variação genética total – FST). Por fim, (4) níveis de fluxo gênico (i,e, migração efetiva) entre populações podem ser estimados.
Figura 13
Figura 14
Loxdale e Lushai mostraram que aloenzimas são marcadores adequados para o estudo da variação intra-específica na maioria dos grupos de insetos vetores. Contudo, triatomíneos em particular tendem a apresentar níveis muito baixos de variabilidade aloenzimática (tanto em termos de heterozigosidade quanto de loci polimórficos), o que impõe certa limitação do uso deste marcador para estudos populacionais. Ainda assim, alguns estudos foram capazes de detectar variação suficiente que permitisse a realização de inferências sobre estrutura populacional.
Populações de T. infestans, por exemplo, são panmíticas dentro de vilarejos Andinos na Bolívia e no Peru, mas altamente estruturadas (e seguindo o modelo de isolamento por distância) entre vilarejos. A análise das frequências alélicas realizada por Dujardin permitiu a determinação da área provável de origem de T. infestans. Estudos posteriores de Breniére indicaram que estruturação dentro de localidades também ocorre, sugerindo que a unidade populacional básica é representada pelas próprias habitações humanas. Empregando metodologia similar, Noireau e colaboradores mostraram que a unidade panmítica de populações bolivianas de T. sordida (grupo aloenzimático 1) é maior do que a descrita para T. infestans, com desvios ao equilíbrio de H-W detectado somente entre populações distando mais de 20km entre si; isso sugere uma melhor capacidade de dispersão de T. sordida do que se supunha anteriormente.
Além disso, a baixa diversidade aloenzimática em Triatominae tem sido vista como possível indicação de maior vulnerabilidade ao controle químico, já que seria menos provável que resistência a inseticidas surgisse em populações geneticamente empobrecidas.
Em taxonomia (ou sistemática alfa, i,e,, identificação e descrição de espécies), a eletroforese de aloenzimas é usada na distinção de espécies crípticas e na determinação do status correto de populações duvidosas. Detecção de isolamento reprodutivo entre duas ou mais espécies crípticas é particularmente fácil quando suas populações são simpátricas. Isso ocorre porque a premissa ‘se as populações pertencem ao mesmo pool gênico, elas têm que estar trocando genes’ pode ser usada como hipótese nula. Então, se loci apresentarem alelos diferentes fixados nas duas populações (i.e. forem diagnósticos), a hipótese nula é rejeitada em favor da hipótese alternativa da existência de mais de um táxon ocorrendo naquela área, como revisto por Thorpe e Solé-Cava.
Esse raciocínio não pode ser aplicado a populações alopátricas, entre as quais troca genética pode não ocorrer simplesmente devido à separação geográfica. Esses casos requerem a comparação de valores de distâncias genéticas par-a-par entre populações, àqueles da literatura. Este método também funciona bem, pois, desde que um número grande de indivíduos e loci são amostrados, distâncias genéticas são muito maiores entre populações de espécies proximamente relacionadas do que entre populações co-específicas.
Valores de corte de distância genética para distinção de espécies têm sido sugeridos como D ≈ 0,16. Em insetos de importância médica, Noireau e colaboradores mostraram valores de D > 0,1 são considerados indicativos de nível específico. Em triatomíneos, Dujardin e colaboradores descreveram valores médios de D = 0,504 ± 0,341 foram detectados em 30 comparações interespecíficas, enquanto populações co-específicas (142 comparações) foram separadas por valores médios de D = 0,013 ± 0,009.
Em geral, quando diferenças claras (loci diagnósticos em simpatria ou distâncias genéticas grandes, em alopatria) foram detectadas entre populações, a conclusão usual foi de que mais de um táxon estava envolvido, ou devido a erros de identificação como R. colombiensis identificado equivocadamente como R. prolixus ou especiação críptica (como com T. sordida). A caracterização de diversas populações cromáticas de T. brasiliensis pareciam representar uma exceção quando diferenças aloenzimáticas fixas foram encontradas entre populações co-específicas por Costa e colaboradores. A visão alternativa de que vários táxons distintos estavam envolvidos foi posteriormente sustentada por análise de sequências de DNA realizada por Monteiro e colaboradores.
Vários exemplos ilustram o uso de aloenzimas na avaliação da taxonomia de triatomíneos. A ausência de diferenças fixas entre R. prolixus (um vetor de grande importância) e R. robustus (silvestre e de importância médica secundária) da Venezuela levou à sugestão de que se tratassem do mesmo táxon. Uma comparação de aloenzimas de indivíduos de prolixus e robustus cuja identidade fora confirmada previamente por DNA mitocondrial continuou sem detectar diferenças. Esse achado foi interpretado por Monteiro e colaboradores como indicação de divergência recente ao invés de co-especificidade. Em casos similares descritos por Flores e Noireau, aloenzimas revelaram diferenciação negligenciável entre espécies proximamente relacionadas dentro dos complexos phyllosoma e oliveirai.
- sordida, T. garciabesi, T. guasayana e T. patagonica são muito parecidas morfologicamente, mas apresentam tendências sinantrópicas distintas; Gorla e colaboradores mostraram que suas áreas de distribuição que se sobrepõe e alta variabilidade anatômica intra-específica dificultam sua identificação. Através da eletroforese de aloenzimas vários estudos confirmaram sordida, guasayana e patagonica como táxons válidos e levaram à revalidação de T. garciabesi e ao descobrimento de duas espécies crípticas dentro de T. sordida e a identidade específica de T. petrochii.
Por fim, a identificação por aloenzimas de espécimes vindos do campo (incluindo ninfas) tem sido fundamental no desenvolvimento de investigações eco epidemiológicas meticulosas. Após a definição de marcadores aloenzimáticos para várias espécies e populações, Noireau e colaboradores investigaram profundamente os ecotópos, o comportamento e a significância epidemiológica de vários triatomíneos bolivianos. Descoberta importante foi o achado de focos silvestres de T. infestans (Figura 15) são muito mais amplos do que se acreditava, estendendo dos planaltos Andinos as áreas do Chaco boliviano.
Figura 15
A interpretação evolutiva de dados aloenzimáticos tem sido feita mediante a interpretação do relacionamento direto entre zimogramas e genes. Relações filogenéticas podem ser investigadas através da comparação de medidas de distância genética derivadas de frequências alélicas. Análises cladísticas se baseiam na capacidade de identificação dos estados primitivos (plesiomórfico) e derivado (apomórfico) dos caracteres do grupo estudado mediante comparação com um ‘grupo de fora’ (outgroup); somente caracteres derivados e compartilhados (sinapomórficos) são usados nas inferências filogenéticas, como revisto por Avise e Thorpe e Solé-Cava. Com base nessas premissas, o relacionamento filogenético de vários grupos de triatomíneos tem sido explorado usando aloenzimas. Esses estudos, em geral, envolvem a avaliação de distâncias genéticas entre poucas espécies proximamente relacionadas, mas investigações mais completas foram realizadas com membros da tribo Rhodniini. Usando técnicas fenéticas Chávez e colaboradores identificaram três agrupamentos principais dentro do gênero Rhodnius: um grupo basal (pallescens (ecuadoriensis-colombiensis)) e dois grupos irmãos (prolixus (nasutusneglectus)) e (stali (pictipes-brethesi)). A maior parte desses relacionamentos foi confirmada por análises cladísticas, embora o grupo (brethesi (pictipes-stali)) tenha aparecido como o mais basal no cladograma; a posição de Psammolestes coreodes dentro da tribo não pôde ser resolvida satisfatoriamente segundo Dujardin e colaboradores. Mais recentemente, a filogenia de Rhodniini foi estudada usando-se 12 loci enzimáticos, Análises de distância genética produziram um dendrograma mostrando a parafilia de Rhodnius, com Psammolestes tertius como grupo irmão do ‘grupo prolixus’ dentro do cluster (domesticus (Ps, Tertius (nasutus-neglectus) (prolixus-robustus))). Um segundo grupo era constituído de (pictipes (brethesi (pallescens-ecuadoriensis))) foi descrito por Monteiro e colaboradores.
Bioquímica
Sistemática bioquímica: Utilização dos padrões de hidrocarbonetos cuticulares em triatomíneos como marcadores taxonômicos
Catarina Macedo Lopes1, Gustavo Calderón2, Juan Girotti2 e Patrícia Juarez2
1- Setor de morfologia e ultraestrutura de artrópodos vetores, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: aniratac@ioc.fiocruz.br
2- Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata da Facultad de Ciências Médicas de La Plata (CONICET – UNLP), Argentina.
E-mail: mjuarez@isis.unlp.edu.ar
É cada vez mais necessário o conhecimento das espécies de triatomíneos que apresentam extensas e diferentes áreas em sua distribuição geográfica; sobretudo daquelas que apresentam elevado potencial em invadir e/ou reinfestar áreas do peri e intradomicilio, mesmo após ações de controle. Ávila-Pires discorreu sobre a necessidade de se realizar o controle racional dos insetos vetores baseado no conhecimento detalhado de seus hábitos, de sua biologia e bioquímica de sua estrutura, uma vez que, as constantes alterações no ambiente natural têm acarretado desequilíbrio nas relações ecológicas, fomentando o processo de dispersão e domiciliação de espécies de insetos que atuam como vetores de patógenos. Com isso, surge a necessidade de se encontrar técnicas sensíveis capazes de identificar variações populacionais objetivando delinear a variabilidade genética dos triatomíneos. Desta forma, vários estudos em andamento utilizam marcadores morfológicos, moleculares e bioquímicos, nos quais estão as técnicas que traçam o perfil dos hidrocarbonetos dos insetos.
Os triatomíneos como os demais insetos apresentam o corpo recoberto de uma fina camada, denominada de epicutícula, cuja composição é em sua maior parte por hidrocarbonetos de cadeias longas, ceras, álcoois graxos e esteróis de longas e complexas cadeias não polares. Esta composição química confere a essa camada diferentes funções, que vão desde atuar como isolante térmico, formar barreira contra desidratação, até a proteção contra absorção de químicos e ação deletéria de microorganismo.
De acordo com Carlson e Service, o perfil dos hidrocarbonetos cuticulares foi utilizado com bastante êxito na elucidação do status específicos de espécies cripticas, em diversos grupos de insetos, demonstrando ser útil para a identificação de espécies, subespécies e até mesmo castas. Este mesmo método vem sendo empregado no estudo da subfamíilia Triatominae, por Juarez e Brenner e Lopes e colaboradores, bem como na classificação dos três principais gêneros de triatomineos envolvidos na transmissão do agente patógeno da Doença de Chagas, por Juarez e colaboradores. Recentemente, Calderón e colaboradores realizaram a análise do perfil de hidrocarbonetos cuticulares apresentado pelas populações geográficas de Triatoma dimidiata.