Genoma

O genoma do Trypanosoma cruzi

Wim Degrave

Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz

E-mail: wdegrave@fiocruz.br

 

Os preparativos

 A bioquímica do Trypanosoma cruzi foi estudada ao longo de várias décadas. Porém, pesquisas sobre a biologia molecular do parasito iniciaram-se de forma simultânea em diversos centros, principalmente na Argentina e no Brasil, coincidindo em parte com o desenvolvimento da biologia molecular.  Kinetoplastida apresentam diversos processos celulares muito peculiares, como o trans-splicing através da adição de mini-exon de 39 nt na parte 5’ de mRNA; a estrutura do cinetoplasto, com seus maxicírculos e minicírculos e mecanismos de editoramento de RNA -“pan-editoramento” nos casos de T. cruzi e T. brucei utilizando RNAs guia (gRNA); um ciclo de vida digenético com diversos estágios, diferentes em forma física, capacidade replicativa e infectiva, e características bioquímicas muito distintas; recombinação sexuada possível porém não muito frequente; cromossomas que não condensam; um kariótipo com grandes variações entre cepas; estruturas teloméricas; controle da expressão gênica primáriamente pós-transcricional com transcrição policistrónica etc.

Um dos primeiros focos de estudo foi o DNA do cinetoplasto (kDNA), tanto do maxicírculo quanto do minicírculo, bem como o seu uso para tipagem e caracterização de cepas de T. cruzi (análise por esquizodema e hibridação). Clonagem, sequenciamento e caracterização de genes de T. cruzi visavam principalmente à identificação de antígenos de superfície do parasito. Assim, foi caracterizado um leque amplo de antígenos, dando início ao desenvolvimento de antígenos recombinantes para fins de diagnóstico. Diversos outros genes e os primeiros elementos repetitivos foram caracterizados (ex ORFS e repetições), principalmente das cepas CL, Y, DM28c, Tulahuen etc. Entretanto, após mais de uma década de pesquisa, o número de genes clonados e sequenciados não passava de 250.

Com o advento dos projetos genomas de diversos organismos no início dos anos ’90 no cenário internacional, a comunidade científica em torno de T. cruzi, Leishmania e T. brucei começou a discutir a possibilidade de iniciar projetos genoma destes parasitos. Já havia sido iniciado um projeto prospectivo de sequenciamento de etiquetas expressas (ESTs) de Schistosoma mansoni, liderado pelos grupos em Belo Horizonte (UFMG e CPqRR-Fiocruz), e a comunidade em torno de Plasmodium se mobilizou igualmente.

O projeto genoma de T. cruzi foi planejado durante várias reuniões em 1993 e 1994, especialmente na Reunião Anual de Pesquisa Básica em Doença de Chagas, Caxambu (5-10 de novembro de 1993), a reunião França – America Latina no Ingebi (Buenos Aires, Argentina, 24-26 de Novembro de 1993) e a reunião anual do Programa para Biotecnologia do Cyted, na Universidade do Chile (Santiago, Chile, março 1994), e cristalizou finalmente na organização da Reunião Internacional de Planejamento para a Rede de Genoma de Parasitos (Parasite Genome Network), na Fiocruz, Rio de Janeiro, 14-15 de abril 1994, pelos Drs. Carlos Morel, Patrick Winckler e Wim Degrave, com suporte da OMS/TDR e da Fiocruz. Nesta reunião, cerca de 50 pesquisadores proeminentes, ativos na pesquisa com T. cruzi, Leishmania ou T. brucei se reuniram e decidiram iniciar os respectivos projetos através de esforço em três redes, de forma coordenada: o Tritryp.

Durante a reunião, o “grupo de Chagas” decidiu iniciar o projeto escolhendo como cepa alvo para os estudos um clone de T. cruzi cepa CL (“clone F11F5”), doravante chamado CL-Brener, em homenagem ao Dr. Zigman Brener, que isolou a cepa e o clone. Esta escolha se baseou nos seguintes argumentos: era um clone estável e disponível, com boa caracterização bioquímica e parasitológica; isolado de caso humano ou de ciclo (peri)doméstico; de fácil cultivo in vitro e em modelo animal; sensível às drogas utilizadas no tratamento da doença de Chagas e considerado representativo para o universo de cepas circulantes de T. cruzi. CL-Brener ainda demonstra uma clara fase aguda em camundongos e em humanos acidentalmente infectados, e provoca uma fase crônica em camundongos, com tropismo para músculo esquelético e de coração. Ainda diferencia in vitro para metacíclicos com razoável eficiência.

 

Os objetivos principais para o projeto eram:

1. Aumentar drasticamente o conhecimento sobre a biologia (molecular) destes parasitos, que apresentam muitas características únicas.
2. Identificar rapidamente um grande número de novos genes com funções chave na célula, e que poderiam ser alvos para novas drogas.
3. Identificar novos antígenos que poderiam ser úteis para o diagnóstico ou o desenvolvimento de vacinas.
4. Analisar as relações evolutivas entre T. cruzi e outros kinetoplastida, e verificar a variabilidade entre cepas, isolados e linhagens do parasito.
5. Analisar a relação entre a estrutura e a função de proteínas e moléculas na célula, e elucidar aspectos da interação entre o parasito e seus hospedeiros (humano, reservatórios e vetores).
6. Construir expertise e colaborações Norte-Sul e Sul-Sul para pesquisa genômica, nas áreas de mapeamento, sequenciamento em larga escala, bioinformática, pesquisa sobre relação estrutura-função de proteínas etc.
7. Contribuir para o conhecimento geral sobre estrutura de genomas, biologia comparativa e evolução dos parasitos.

 

Nos anos iniciais do projeto, foram organizadas diversas iniciativas de coordenação e workshops, entre elas um curso International Training Course on Parasite Genome Projects: Strategies and Methods, e o Symposium on Genome Projects, no Ingebi, Buenos Aires, Argentina, nov. 13-24, 1995, reuniões de coordenação, com financiamento pela OMS/TDR e outros, em Teresópolis (Brasil, abril 10-12, 1996), no Rio de Janeiro (Brasil, junho 9-11, 1997), e posteriormente como parte do TriTryp, em Hinxton, Inglaterra.

 

Os primeiros passos

Ainda em 1994 e 95, as características biológicas do clone CL-Brener foram estudadas em mais detalhes, bem como a tipagem molecular utilizando zimodema, esquizodema, RAPD e marcadores moleculares, e verificada a estabilidade genética durante mais de 100 gerações.  Um laboratório de referência (Dra. Bianca Zingales, Dept. de Química, USP, SP) ficou responsável pela guarda e distribuição do clone CL-Brener.

No início de 1996, foram descobertos marcadores moleculares (18S e posteriormente o mini-exon) que poderiam discriminar os isolados e cepas de T. cruzi em duas linhagens principais, mais tarde renomeadas como T. cruzi I (ciclo silvestre) e T. cruzi II (ciclo doméstico-mamífero-humano). Posteriormente, mais subdivisões foram propostas. Além disto, modelos foram propostos para correlacionar manifestações clínicas com populações e clones infectantes. CL-Brener foi inicialmente identificado como T. cruzi II, e foi escolhido o clone Dm28c como representante de T. cruzi I.

A análise detalhada do kariótipo de T. cruzi CL Brener e de outras cepas foi feita, bem como a análise de grupos de ligação, e a descrição de marcadores cromossomais. Dependendo do trabalho, utilizou-se um sistema de numeração com 20 a 42 bandas de 0,45 Mb até 3,5 Mb, numeradas de I a XX (em baixa resolução) ou de 1 a 42 (em média resolução), sendo que o número total de bandas parecia estar em torno de 72 (ou 36 pares de cromossomas). O tamanho do genoma diplóide de CL-Brener foi estimado na época em 87 Mb. Grupos de ligação foram identificados, e observaram–se diferenças importantes em tamanho entre cromossomos aparentemente homólogos. Os cariótipos de diferentes cepas de T. cruzi são muito diferentes, e foi argumentado por diversos grupos que CL-Brener, ou T. cruzi II teria um tamanho de genoma substancialmente maior que cepas de T. cruzi I, com frações adicionais de sequências repetitivas, totalizando até 50% do genoma.

Foram construídos diferentes tipos de bibliotecas para iniciar mapeamento e sequenciamento: bibliotecas de CL-Brener YAC, BAC e cosmídeos, bem como de cDNA (epimastigotas, biblioteca normalizada e não-normalizada) e uma biblioteca genomica em lambda zap.

O sequenciamento propriamente dito foi iniciado em diversos centros com análise de ESTs, de cosmídeos do cromossoma 3, e com uma análise genomica aleatória (GSS).

Os dados e os progressos do projeto genoma eram apresentados em paginas web, e uma versão detalhada foi feita em banco de dados winace, chamado TcruziDB.  Os colaboradores principais desta fase foram os Drs. John Swindle, Bjorn Andersson, John Kelly, Ulf Pettersson, Lena Aslund, Edson Rondinelli, Turan Urmenyi, Jacqueline Bua, Andres Ruiz, Andrea Macedo, Bianca Zingales, Carlos Frasch, Denis le Paslier, Jose Luis Ramirez, Rafael Aldao, Antonio Gonzalez, Adeílton Brandão, José Maria Requena, Mariano Levin, Jose Franco da Silveira, Wim Degrave e outros, de tantos centros de pesquisa, e países. O suporte da OMS/TDR (o manager do “parasite genome networks” era inicialmente Dr. Felix Kuzoe, depois Boris Dobrokhotov, e posteriormente Ayoade Oduola) principalmente através do financiamento de uma reunião anual, foi essencial para a agregação dos grupos em torno do objetivo, e para assegurar a cooperação e a inclusão dos grupos de países endêmicos.

Em 1999, o consórcio de laboratórios enviou cartas de suporte para uma aplicação para financiamento pelo NIAID. Este suporte foi concedido/confirmado em 2000 para um consórcio (TSK-TSC) da Universidade de Uppsala, Karolinska Institute (Bjorn Andersson), TIGR (Najib El-Sayed) e SBRI (Ken Stuart, Peter Mayler) para o sequenciamento genômico completo, em duas fases.

Muito trabalho em mapeamento físico foi investido, principalmente pelo grupo do Dr. José Franco da Silveira e colaboradores, utilizando a biblioteca de YACs. O mapeamento cuidadoso da estrutura dos telômeros de T. cruzi e da região subtelomérica também foi publicado.

A caracterização mais detalhada de CL-Brener, com mapeamento comparativo de grupos de ligação (linkage mapping) e a distribuição de sequências repetitivas no genoma foi feita por diversos grupos.

Os primeiros relatórios sobre provável heterozigose do clone CL-Brener foram publicados em 2001 e posteriormente confirmados por diversos grupos. Isto colocava um problema grande para os grupos de sequenciamento, já que Bjorn Andersson relatava que genes em cromossomos “homólogos” tinham até 2% de divergência nucleotídica mesmo em sequências codantes. Devido ao alto conteúdo de sequências repetitivas, isto colocaria desafios extremos para a fase de montagem do genoma.

 

O sequenciamento completo

A sequência genômica do T. cruzi CL-Brener foi oficialmente publicada junto com as sequências genômicas completas de L. major e T. brucei, na revista Science em 2005. A montagem do genoma foi apenas parcial, devido às muitas dificuldades com sequências repetitivas, e a heterozigose do clone. Assim, foram preditas 22.570 proteinas, das quais 12.570 formam pares alélicos. Além de retrotransposons e outros elementos repetitivos, havia muitos genes pertencentes a grandes famílias de proteínas de superfície, como as trans-sialidases, mucinas, gp63 protease, e proteínas associadas a mucinas (MASP), os quais representam cerca de 18% de todas as sequências codantes. Diversos aspectos bioquímicos e moleculares específicos para os Tritryps foram observados.

As sequências genomicas foram obtidas através de sequenciamento aleatório (shot-gun) até uma densidade de 16x, com 53.4% GC. Foi obtido também 2.5x cobertura de T. cruzi Esmeraldo, para ajudar na montagem. A montagem totaliza 67 Mb em 8740 contigs, representando boa parte do genoma diploide não-repetitivo. Estima-se uma divergência de 5.4% entre os dois haplótipos em CL-Brener em regiões não-codantes, e 2.2% em regiões codantes. Estima-se que T. cruzi contem cerca de 12.000 genes (genoma haploide), entre codantes para proteínas, e genes para rRNA, slRNA e snoRNA. Para as sequências protéicas preditas, cerca de 50.8% receberam uma indicação potencial quanto a uma possível função, baseada em análises de similaridade. Foram mapeados 6.158 COGs (clusters de grupos ortólogos) comuns entre os tritryps, e adicionalmente 458 compartilhados entre T. cruzi e T. brucei; 482 entre T. cruzi e L. major, e 3.736 específicos para T. cruzi.

Mais de 50% do genoma de CL-Brener é repetitivo (entre genes codantes repetidos, micro- e minisatélites, repetições LTR e não-LTR etc.) com pelo menos 1.052 clusters de parálogos, dos quais pelo menos 46 com mais de 20 membros.

Genes potencialmente codantes para a maquinaria de reparação de DNA, recombinação, replicação e meiose foram encontrados, com muitas similaridades e também divergências em comparação com o conjunto em levedura.

Muitas adenilato ciclases, proteína fosfatases e especialmente kinases foram identificadas, bem como multiplas enzimas envolvidas com o metabolismo de fosfoinositídeos, com diferenças consideráveis em comparação com as famílias e as estruturas de domínio correspondentes em humanos.

Entre as proteínas de superfície, muitas são intensamente glicosiladas. T. cruzi obtem o ácido siálico do hospedeiro através da transialidase e o transfere para mucinas. As estruturas, funções e a variabilidade gênica das superfamílias envolvidas ainda são muito pouco compreendidas.

A comparação das estruturas genômicas e proteínas preditas com as de L. major e T. brucei indica mais similaridade entre T. cruzi e T. brucei, uma grande conservação entre os respectivos proteomas (exceto para antígenos de superfície), e uma sintenia muito extensa, apesar da divergência há 200-500 milhões de anos atrás.

 

Genomica funcional

A partir da sequência genomica parcialmente montada e o conjunto de proteínas preditas disponibilizadas, muitas pesquisas na área de genômica funcional são necessárias para aprofundar os conhecimentos e para verificar e confirmar hipóteses. Como ferramentas para estes estudos, podemos mencionar:

1. Um conjunto de vetores de transformação transiente (ex. pTex), e integrativa estável (pRibotex, pTrex, e outros) foi desenvolvido.
2. Um sistema de fragmentação cromosomal utilizando telômeros artificiais, bem como vetores provocando a replicação como cromossomas artificiais de T. cruzi.
3. Análise de expressão gênica através de microarranjos.
4. Análise do proteoma de T. cruzi.

Recentemente foram caracterizadas regiões centroméricas, contendo regiões ricas em GC com região de troca de fita de transcrição (transcriptional strand switch region) ricos em fragmentos de retrotransposons degenerados.

Muitos projetos estão em andamento, estudando genomica comparativa, reconstrução metabólica, caracterização bioquímica com busca de novos alvos para drogas, expressão gênica durante os diversos estágios de vida do parasito etc.

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Populações

Estrutura populacional do Trypanosoma cruzi

Andrea Macedo

Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,

E-mail: andrea@icb.ufmg.br

 

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, exibe um alto grau de polimorfismo intraespecífico, incluindo desde aspectos morfológicos (formas delgadas, largas e intermediárias, já observadas por Carlos Chagas no começo do século) até refinados marcadores moleculares descritos mais recentemente (revisado por Macedo e colaboradores em 2004).

Dentre os marcadores moleculares mais estudados podemos destacar as análises eletroforéticas de isoenzimas, também chamadas de zimodemas ou MLEE – Multilocus Enzyme Electrophoresis; os esquiizodemas obtidos a partir de perfis de restrição do kDNA; o polimorfismo detectado pelas técnicas de impressões digitais de DNA (Macedo et al, 1992), LSSP-PCR – Low Stringency Single Primer -PCR, RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA e cariotipagem; ou ainda a variabilidade observada nos perfis de microssatélites, genes de rDNA, mini-exon; mitocondriais dentre outros.

A heterogeneidade genética do taxon T. cruzi tem profunda significância biológica. O conjunto de características heterogêneas das populações de T. cruzi, juntamente com os hábitos alimentares dos insetos vetores e o conjunto de hospedeiros vertebrados presentes em um determinado ambiente, define dois ciclos de transmissão do T. cruzi: o ciclo silvestre, que envolve principalmente marsupiais e pequenos roedores silvestres, e o ciclo doméstico, que acomete o homem e alguns outros mamíferos do ambiente peridomiciliar.

Evidências diversas têm demonstrado que várias populações de T. cruzi são policlonais. Na verdade, esta é uma expectativa teórica considerando-se a história natural do T. cruzi. Pacientes em áreas endêmicas provavelmente infectam-se múltiplas vezes por contato com diferentes triatomíneos, os quais por sua vez, alimentam-se de indivíduos diferentes. Esta “promiscuidade” propicia a formação de populações multiclonais em hospedeiros definitivos e vetores, que quando isoladas e caracterizadas em laboratório são designadas de isolados e/ou cepas.

 

Linhagens principais de T. cruzi

 T. cruzi é uma espécie muito polimórfica e a sua estrutura populacional está longe de ser completamente compreendida. Durante muitos anos, prevaleceu a idéia de que as populações de T. cruzi não poderiam ser agrupadas em clusters discretos que representassem taxons naturais da espécie. Ao contrário, foi proposta uma estrutura multiclonal para as populações de T. cruzi, nas quais diferentes clones evoluiriam basicamente pela reprodução clonal a partir de um ancestral comum mais antigo. Entretanto, a identificação de significativa similaridade entre algumas populações de T. cruzi, revelada por diferentes marcadores moleculares, gerou um consenso sobre a existência de pelo menos duas linhagens filogenéticas principais dentro da espécie T. cruzi. A dicotomia inicial proposta para o T. cruzi foi posteriormente reforçada com uma grande variedade de outros marcadores epidemiológicos, bioquímicos, biológicos e moleculares, mas a designação dos grupos principais nos diferentes trabalhos era muito confusa. Em 1999, em um esforço para homogeneizar a nomenclatura adotada pelos diferentes grupos pesquisa, as duas linhagens principais foram renomeadas de T. cruzi I e T. cruzi II. Ficou então estabelecido que, a partir daquela data, seriam designadas como T. cruzi I as cepas equivalentes ao Zimodema 1, ao Tipo III, à linhagem 2 do rDNA, ao Grupo I, aos Ribodemas II/III ou similares. Como T. cruzi II seriam designadas as cepas equivalentes ao Zimodema 2, Zimodema A ao Tipo II, à linhagem 1 do rDNA, ao Grupo II, ao Rimodema I ou similares. A designação das cepas do Zimodema 3 e daquelas aparentemente híbridas, como as classificadas como Zimodema 2b Chileno, Zimodema B, Tipo I, Grupo 1/2 do rDNA, ou clonet 39 seria decidida após estudos adicionais.

Subsequentemente, utilizando-se análises de isoenzimas e RAPD, Brisse e colaboradores (2000), propuseram a subdivisão do taxon T. cruzi em seis linhagens ou DTUs (Discret Taxonômica Units) I, IIa, IIb, IIc, IId, IIe, sendo o DTU I correspondente à linhagem T. cruzi I e o DTU IIb correspondente à linhagem T. cruzi II. As sublinhagens IIa, IIc-e incluem as cepas híbridas e aquelas pertencentes ao zimodema 3. Apesar de não ter sido oficialmente recomendada, esta nomenclatura vem sendo muito citada pela comunidade científica.

Mais recentemente, Freitas et al., 2006, utilizando um conjunto de 7 marcadores moleculares, incluindo o polimorfismo associado a 5 locos de microssatélites e a dois genes: um nuclear (rDNA 24Sa) e outro mitocondrial (COII – subunidade II da citocromo oxidase), propuseram a existência de uma terceira linhagem principal em T. cruzi, designada de T. cruzi III.

A equivalência das nomenclaturas dos principais grupos ou linhagens de T. cruzi, determinados através do uso de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares é apresentada no Quadro 1.

 

CL Brener e as cepas híbridas de T. cruzi

As cepas com características híbridas têm despertado grande interesse da comunidade científica, especialmente após a elegante demonstração da capacidade de recombinação de células de T. cruzi em laboratório. Neste trabalho, através da seleção artificial de parasitos recombinantes resistentes a drogas, foi demonstrada a fusão dos genótipos nucelares parentais com perda de alelos e evidências processos de recombinação homóloga. Curiosamente, em todos os casos, observou-se a ausência de fusão do DNA mitocondrial, sugerindo um modelo de recombinação no qual um dos parentais é o “doador”, que contribui apenas com material nuclear e o outro o “receptor”, que mantém o seu DNA do cinetoplasto.

É importante ressaltar que, apesar de ser capaz de recombinação, pelo que se conhece até o momento, o T. cruzi se reproduz predominantemente através de fissão binária. Por conseqüência, o seu genótipo nuclear diplóide é transmito en bloc para a prole, o que provavelmente resulta nos elevados níveis de desequilíbrio de ligação observados e na estrutura tipicamente clonal da população de parasitos.

Apesar da fusão de células de T. cruzi não ser aparentemente um fenômeno comum, estudos baseados em análises de padrões de isoenzimas, RFLP de genes constitutivamente expressos, RAPD, análises de cariótipos, e de análises de seqüências nucleares e mitocondriais têm confirmando a existências de várias destas populações híbridas. Interessantemente, Freitas e olaboradores (2006) demonstraram que todas as cepas híbridas naturais, até agora analisadas, são resultantes de eventos distintos de hibridização, envolvendo populações das linhagens T. cruzi II e T. cruzi III, sendo esta última sempre a população receptora, que mantém o DNA mitocondrial.

O clone CL Brener, na verdade, é um bom exemplo da complexidade e da dificuldade de se determinar com exatidão a estrutura populacional e filogenia da espécie T. cruzi. Inicialmente, com base nos marcadores de rDNA 24 Sa, mini-exon e RAPD, este clone foi incluído entre as cepas pertencentes à linhagem T. cruzi II. Todavia, com a ampliação dos estudos de polimorfismos de outras regiões expressas ou não do genoma ficou claramente demonstrado que o Cl Brener é um clone híbrido. Inicialmente este clone foi interpretado como resultante de evento de hibridização entre as linhagens T. cruzi I e T. cruzi II, mas atualmente é reconhecido como um híbrido originado da fusão de cepas das linhagens T. cruzi II e T. cruzi III, também chamadas de DTU IIb e IIc, respectivamente.

 

Implicações clínicas da variabilidade genética do T. cruzi

Uma das questões atuais mais intrigantes na doença de Chagas se relaciona ao possível papel da diversidade genética de populações de T. cruzi na determinação das diferentes formas clínicas desta parasitose. Embora com quase 100 anos desde sua descoberta por Carlos Chagas, pouco se conhece sobre os fatores determinantes das manifestações clínicas da doença, e mesmo a existência de um papel relevante do parasito neste processo já foi questionado. De fato, os seres humanos podem ser considerados como um acidente recente na história evolucionária de T. cruzi. Estima-se que o T. cruzi tenha emergido como espécie há 150 milhões de anos, mas provavelmente o primeiro contato com homem foi muito mais recente, há aproximadamente 15.000 anos atrás, quando o homem povoou as Américas. Assim, é natural supor que nem toda população de T. cruzi possa infectar seres humanos e causar a doença de Chagas. Até recentemente, prevaleceu o entendimento de que a linhagem T. cruzi II estaria mais associada ao ciclo doméstico de transmissão da infecção pelo T. cruzi e, portanto, à patologia da doença humana. Embora esta idéia ainda prevaleça para as regiões endêmicas clássicas do Cone Sul (Brasil e Argentina), está cada vez mais evidente que, para países do norte da América do Sul (norte do Brasil, Bolívia, Colômbia e Venezuela), T. cruzi I talvez seja a principal linhagem envolvida na doença de Chagas humana.

O mecanismo pelo qual as diferentes formas clínicas da doença se estabelecem, permanece obscuro. Certamente fatores associados ao paciente estão envolvidos, mas está cada vez mais evidente a existência de um papel fundamental associado a aspectos genéticos do parasito. Por outro lado, a despeito do empenho de vários pesquisadores neste sentido, ainda não foi possível correlacionar diversidade genética dos parasitos com as características clínicas da doença. Uma possível explicação para esta aparente ausência de correlação é que várias cepas de T. cruzi são constituídas por diferentes subpopulações ou clones que podem apresentar tropismo para diferentes tecidos (revisado por Macedo e colaboradores., 2004). Assim um fator importante na determinação do curso clínico da doença parece ser a constelação de clones infectantes e seus tropismos específicos. Como a maioria das técnicas usadas para a genotipagem do T. cruzi requer o isolamento do parasito do sangue do paciente e sua manutenção em cultura, há uma ampla oportunidade para a ocorrência de seleção clonal, de maneira que as populações de parasitos disponíveis para as análises podem diferir daquelas que realmente causam a lesão do tecido e, provavelmente, as manifestações clínicas. Este cenário, que constitui o núcleo do modelo histrotópico-clonal da doença de Chagas, pressupõe a necessidade de se analisar a diversidade genética dos parasitos diretamente nos tecidos infectados. Atualmente, já há disponível uma série de marcadores com sensibilidade suficiente para serem utilizados em estudos genotipagem do T. cruzi diretamente em tecidos de pacientes, o que certamente abre novos horizontes para o ecoepidemiologia molecular da doença de Chagas. Todavia, há que se observar, obviamente, em que situações estas análises diretamente em tecidos de pacientes seriam eticamente recomendadas e adequadas.

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Arquitetura Genômica

Arquitetura genômica e composição gênica do parasito Trypanosoma cruzi

Santuza M.R. Teixeira

Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas

E-mail:

 

Daniella C. Bartholomeu

Departamento de Parasitologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas

E-mail:

 

O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas ou tripanossomíase americana, que afeta de 16 a 18 milhões de indivíduos na América Latina. Os sintomas clínicos da doença de Chagas são altamente variáveis, podendo apresentar-se desde a forma assintomática, que é a mais comum, até o comprometimento severo do coração e/ou do trato digestivo. Os fatores que determinam a variabilidade clínica da doença de Chagas não são bem conhecidos, sendo consensual a idéia de que tanto a constituição genética do parasito quantodo hospedeiro devam exercer papéis importantes na determinação do curso da infecção.

Estudos epidemiológicos, bioquímicos e moleculares têm demonstrado que o táxon T. cruzi é extremamente heterogêneo tanto genotipicamente quanto fenotipicamente. Apesar de sua reprodução ser predominantemente clonal, evidências de raros eventos envolvendo troca de material genético já foram detectadas em inúmeros trabalhos que buscam estudar a estrutura populacional do parasito. Baseado em vários marcadores moleculares, o táxon T. cruzi foi dividido em duas linhagens geneticamente distintas, as quais receberam a denominação T. cruzi I e T. cruzi II. Posteriormente foi proposto que a linhagem II fosse subdividida em cinco sub-linhagens (IIa – IIe. Em contraste, a linhagem I não comporta nenhuma subdivisão. Recentemente, foram reportadas evidências para a existência de uma terceira linhagem denominada T. cruzi III, na qual foram incluídas cepas que não haviam sido classificadas com base na dicotomia T. cruzi I e T. cruzi II. Apesar da reprodução clonal ser de longe a estratégia reprodutiva predominante em T. cruzi, a caracterização molecular de cepas híbridas mostrou que troca de material genético ocorreu definitivamente no passado. Além disso, híbridos derivados de cepas do grupo T. cruzi I foram gerados experimentalmente confirmando a capacidade do T. cruzi de realizar troca genética.

A grande divergência genética entre as linhagens de T. cruzi I e II é refletida em muitos aspectos epidemiológicos e patológicos da doença de Chagas. Em países do Cone Sul da América do Sul onde a doença de Chagas é mais severa, T. cruzi I é associado ao ciclo silvestre infectando principalmente mamíferos arbóreos, enquanto T. cruzi II predomina nos ciclos domésticos infectando o homem e outros mamíferos terrestres. Evidências epidemiológicas e genotipagem de parasitos diretamente de tecidos humanos infectados têm demonstrado que a linhagem T. cruzi II é o agente causal predominante da doença de Chagas nesta área. Por outro lado, T. cruzi I predomina na bacia Amazônica e em áreas endêmicas da doença de Chagas na Venezuela. Para revisões sobre a estrutura populacional de T. cruzi e sua relação com a doença de Chagas veja Buscaglia e Di Noia e Macedo e cols, Zingales e cols.

Devido ao fato da família Trypanosomatidae ter divergido muito cedo da linhagem evolutiva que deu origem aos eucariotos superiores, seus membros apresentam aspectos relacionados à organização e expressão de genes bastante peculiares. Particularidades na estrutura e organização cromossômica tornam difícil a visualização de cromossomos metafásicos distintos, não tendo sido ainda definido o número exato de cromossomos na espécie uma vez que estes não se condensam durante a divisão celular. Entretanto, análises de PFG (pulse field electrophoresis) de várias cepas seguidas de hibridação com sequências teloméricas e sondas de genes conservados levaram à conclusão de que trata-se de um genoma diplóide com um número estimado entre 20 e 40 cromossomos homólogos apresentando tamanhos bastante diferentes. Além do genoma nuclear, todos os membros da ordem Kinetoplastida apresentam um genoma extra-nuclear, denominado DNA do cinetoplasto, ou kDNA, que pode representar 20-25 % do conteúdo total de DNA.  O kDNA de T. cruzi é formado por uma rede contendo aproximadamente 40-50 maxicírculos de 22 a 28 kb que correspondem ao DNA mitocondrial dos eucariotos e 5.000-10.000 minicírculos de aproximadamente 1,5 kb com sequências altamente variáveis e cuja função está relacionada ao processo de edição de mRNAs que codificam proteínas mitocondriais.

Outra característica peculiar do genoma dos tripanosomatídeos é a presença de longas unidades de transcrição policistrônica, que inclui vários genes organizados em tandem os quais, em geral, não são funcionalmente relacionados. Ao sequenciar o primeiro cromossomo de um tripanosomatídeo, em 1999, Myler e cols. mostraram que o cromossomo 1 de Leishmania major é composto de duas unidades policistrônicas contendo 29 genes em tandem codificados em uma das fitas e 50 genes codificados na fita oposta, com uma região de inversão entre os dois clusters direcionais de transcrição.  Essa estrutura, contendo longos clusters de transcrição mostrou-se bastante similar nos outros tripanosomatídeos, como ilustrado na (Figura 1).

 

Figura 1 – Cromossomos 7 e 10 de Trypanosoma brucei alinhados com cromossomos de L. major e regiões correspondentes no genoma do T. cruzi.

 

Vários grupos demonstraram que, similar a procariotos, a transcrição dos genes nos tripanossomatídeos é policistrônica. Surpreendemente, em T. brucei como também em genes exógenos introduzidos no T. cruzi por eletroporação, mRNAs podem ser gerados por ação da RNA polimerase I.  Entretanto, como em eucariotos, os pré-mRNAs são processados no núcleo para formar mRNAs citoplasmáticos maduros, monocistrônicos. Para que os mRNAs maduros sejam produzidos são necessários dois eventos pós-transcricionais: adição da cauda poli-A à extremidade 3` dos mRNAs e adição de uma sequência conservada de RNA de 39 nucleotídeos à extremidade 5`, chamada de spliced leader (SL) ou mini-éxon, através do mecanismo de trans-splicing (Figura 2). A sequência do SL, encontrada somente em tripanossomatídeos e em nematódeos, é idêntica em todos os mRNAs de um mesmo organismo, mas é diferente entre as espécies. Uma outra característica nos genes de tripanossomatídeos também típica de procariotos é a escassez de íntrons, os quais foram identificados em apenas quatro genes. Para uma revisão sobre os mecanismos de expressão de genes em tripanosomatídeos, veja Teixeira e DaRocha.

 

Figura 2: Modelo de trans-splicing do T. cruzi.

 

Em 2005 a sequência completa do genoma do clone CL Brener de T. cruzi foi obtida por um consórcio internacional, juntamente com os dados do genoma de dois outros tripanosomatídeos causadores de importantes doenças tropicais, o T. brucei e a L. major. CL Brener é uma cepa híbrida classificada por alguns grupos como pertencente à sub-linhagem IIe e foi selecionada como a cepa referência do projeto genoma devido a inúmeros trabalhos que já haviam sido publicados com essa cepa incluindo análises de sequenciamento de EST (expressed sequence tag) de várias formas do ciclo de vida do parasito. O genoma da cepa CL Brener, estimado entre 106.4 and 110.7 Mb foi sequenciado usando a estratégia WGS (Whole Genome Shotgun) com cobertura de 14x. Uma vez que se trata de um genoma híbrido, esta alta cobertura tinha como objetivo permitir adequada representatividade dos dois haplótipos correspondentes à cada uma das linhagens parentais presentes no genoma do clone CL Brener. Além disto, foi necessária a modificação dos algoritmos usados na montagem do genoma a fim de evitar misturar os dois haplótipos nos contigs gerados por WGS. Para distinguir os dois haplótipos, foram ainda realizadas comparações pós-montagem envolvendo sequências dos contigs de CL Brener e sequências de WGS obtidas de bibliotecas construídas a partir do DNA de um representante do grupo parental IIb (que corresponde à cepa Esmeraldo). Desta forma foram identificados pares de alelos para metade dos genes de CL Brener. A anotação da sequência completa do genoma, o qual apresenta um conteúdo de G+C de 51 %, indicou a existência de 22.570 genes codificando proteínas sendo que destes, 12.570 representam pares de alelos. Deste total de aproximademante 12.000 genes foi possível determinar a função de 50.8% com base na literatura e em resultados de similaridade com proteínas já caracterizadas ou na presença de domínios funcionais característicos. A maior parte das diferenças identificadas nos dois haplótipos presentes no genoma do clone CL Brener corresponde a inserções e deleções em regiões intergênicas e subteloméricas e regiões com amplificações de sequências repetitivas, sendo a divergência média entre os dois haplótipos de 5.4%, valor esse que diminui para 2.2% nas regiões codificadoras.

O alto percentual de seqϋências repetitivas in tandem no genoma é uma outra caracterísitica marcante e que dificultou bastante a montagem dos contigs: Devido a essa característica, a montagem completa do genoma do T. cruzi não foi totalmente concluída, sendo a maior parte das sequências não incorporadas aos contigs elementos repetitivos não codantes ou membros de famílias multigênicas organizadas in tandem. Os dados sobre a porção montada e anotada do genoma de T. cruzi, correspondente a 838 scaffolds (contendo 4008 contigs e totalizando 60.4 Mb), encontram-se disponíveis nos sites GENEDB  e TritrypDB.

Uma vez que os genomas do T. brucei e da L. major foram sequenciados simultaneamente foi possível a realização de interessantes análises de genômica comparativa entre os três organismos, demonstrando a existência de altos níveis de sintenia (conservação da ordem dos genes) entre os três genomas (figura 1). Esses estudos também permitiram investigar a história evolutiva dos cromossomos destes organismos. Postulou-se que a arquitetura genômica atual de T. cruzi e L. major provavelmente se assemelha uma organização genômica fragmentada do genoma ancestral, o qual teria sofrido vários eventos de fusão cromossômica durante a geração da linhagem que deu origem ao T. brucei. Essas análises revelaram ainda a existência de vários genes exclusivos da família tripanosomatídea, alguns deles considerados excelentes candidatos para estudos que estão sendo conduzidos na presente etapa da pesquisa “pós-genômica”, os quais poderão identificar novos alvos para desenvolvimento de drogas e formas de controle das doenças causadas por esses organismos.

A quase totalidade dos dados publicados sobre a estrutura e organização do genoma do T. cruzi refere-se a sequências pertencentes ao clone CL Brener. Raros são os trabalhos, mesmo aqueles voltados para estudos de genes individuais, contendo dados derivados de seqϋências do genoma de cepas pertencentes à linhagem T. cruzi I ou III. Pouco se sabe, portanto, sobre as importantes diferenças que devem existir no genoma de cepas pertencentes às linhagens distintas de T. cruzi e que seriam responsáveis pelas visíveis diferenças no comportamento biológico e nos dados de epidemiologia da doença de Chagas. Análises de cariótipos de algumas dessas cepas indicam um tamanho médio do genoma de cepas pertencentes à linhagem T. cruzi I significativamente menor do que cepas da linhagem T. cruzi II. Essa diferença é consequência, entre outras, de uma redução na quantidade de sequências repetitivas, como por ex., o DNA satélite de 195 bp.

Outras diferenças já detectadas entre cepas pertencentes às linhagens T. cruzi I e II e que devem se refletir em diferenças na estrutura e organização do genoma das cepas, estão relacionadas às maquinarias de reparo de DNA no parasito. Em 2003 Augusto-Pinto e cols. estudando proteínas envolvidas na via de reparo de erros de pareamento, MMR (mismatch repair), observaram que as cepas Colombiana (T. cruzi I), JG (T. cruzi II) e CL-Brener (cepa híbrida) apresentam níveis distintos de instabilidade de microssatélite em resposta ao stress oxidativo. Além disto, cepas de T. cruzi II revelaram-se mais resistentes ao tratamento com cisplatina; um fenótipo indicativo de uma maquinaria de reparo pouco eficiente. Esses resultados estão de acordo com dados recentes também do nosso grupo que indicam um maior nível de polimorfismos em famílias de genes multicópias presentes no genoma de cepas do grupo T. cruzi II quando comparadas com sequências do grupo I.  Com base nesses estudos nosso grupo propôs que uma menor eficiência da maquinaria de reparo em cepas do grupo T. cruzi II poderia resultar na geração de maior variabilidade genômica nas cepas deste grupo. Certamente estudos sobre o genoma de cepas pertencentes à linhagem T. cruzi I são essenciais para que possamos ter um quadro completo do genoma da espécie T. cruzi.

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In silico

Genoma e abordagens in silico

Alberto Martín Rivera Dávila

Laboratório de Biologia Computacional e Sistemas,IOC, FIOCRUZ

Email: davila@fiocruz.br

Em construção

 

Regulação Gênica

Regulação da Expressão gênica em Trypanosoma cruzi

Samuel Goldenberg

Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Instituto Carlos Chagas/Fiocruz

E-mail: sgoldenb@tecpar.br; sgoldenb@fiocruz.br

 

O Trypanosoma cruzi, assim como outros Tripanosomatídeos, apresenta algumas caracteristicas bastante peculiares em termos biológicos, refletindo-se na organização e função do seu genoma. A constituição genética do T. cruzi demonstra a existência de um grande polimorfismo, tendo como consequência uma significativa variação na quantidade de DNA nuclear e no número de cromossomos entre diferentes isolados do parasita. Diferentemente da maioria dos organismos eucarióticos, os genes de T. cruzi e dos outros tripanosomatídeos não são em geral interrompidos pelas sequências de inserção (“introns”).

Os mRNAs (RNAs mensageiros) do T. cruzi apresentam na sua extremidade 5’ a estrutura do cap e na extremidade 3’ uma sequência de poli-A. A estrutura do cap dos tripanosomatídeos é diferente da estrutura cap dos mRNAs de outros eucariotos pois é altamente modificada e é proveniente de outro transcrito denominado de mini-exon ou “spliced leader” (SL) RNA. Assim, todos os mRNAs do T. cruzi possuem em sua extremidade 5’ uma mesma sequência comum.

Esta sequência comum (SL-RNA) ou mini-exon é adicionada após a transcrição dos mRNAs através de um mecanismo peculiar chamado de “trans-splicing” (2006). A sequência do SL-RNA é codificada em local distinto do genoma do parasita e adicionada a cada precursor de mRNA transcrito. Este mecanismo de processamento de mRNA é bastante particular, refletindo a peculiaridade do processo de transcrição de mRNAs em si pois diferentemente dos outros eucariotos, os mRNAs de tripanosomatídeos são transcritos como unidade policistrônicas (ou seja, diferentes mensagens em uma mesma unidade de transcrição). Todavia, diferentemente da transcrição policistronica descrita em procariotos, os diferentes mRNAs co-transcritos nos tripanosomatídeos em geral não estão relacionados em termos de funcionalidade ou expressão temporal dos produtos de tradução (proteínas codificadas). Adicionalmente, não foram evidenciados promotores para a RNA polimerase II nas regiões a montante da maioria dos genes que codificam proteínas nos tripanosomatídeos. No caso do T. cruzi, assim como nos outros tripanosomatídeos estudados, foram evidenciados promotores para a RNA polimerase I e o promotor para a mini-exon, que é transcrito por uma RNA polimerase II. Todavia vale ressaltar que os genes que codificam as três RNA polimerases de eucariotos foram descritos nos tripanosomatídeos.

Assim, a regulação da expressão gênica em tripanosomatídeos ocorre principalmente a nivel pós-transcricional. De fato, imagina-se que os genes são transcritos e processados continuamente (transcrição relaxada) e sua expressão é então regulada seja pelo transporte seletivo para o citoplasma, seja pela estabilidade do mRNA ou então pela seleção das sequências de mRNA que serão traduzidas, através de um mecanismo de mobilização polisomal diferencial. No caso da estabilidade, que é um fenomeno largamente estudado nos tripanosomatídeos, a maior parte dos estudos se concentram em demonstrar o papel da região 3’-não codante (3’-UTR). Obviamente a sequência UTR em si não tem o papel regulador mas sim as proteínas a elas associadas. Estas proteínas poderiam então modular a expressão gênica, participando da seleção das sequências de RNA mensageiro a serem traduzidas já que várias evidências apontam para um mecanismo de mobilização seletiva de sequências de mRNA para os polisomos.

Ainda há um vasto campo a ser elucidado e pesquisado concernente à regulação da expresssão gênica em tripanosomatídeos. Com a determinação da sequência genômica dos três tripanosomatideos de relevância para a saúde humana (T. cruzi, T. brucei e Leishmania major) com o uso de ferramentas de análise genômica e pós-genômica e com o avanço dos estudos voltados para a epigenética,  novos mecanismos deverão ser evidenciados.

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K-DNA

O DNA do cinetoplasto (kDNA) de Trypanosoma cruzi e aplicações

Constança Britto

Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz

E-mail: cbritto@ioc.fiocruz.br

 

Variabilidade genética do kDNA aplicada a estudos de epidemiologia molecular da doença de Chagas

A extensa heterogeneidade de sequência das milhares de moléculas de minicírculos que compõem a estrutura em rede do DNA do cinetoplasto, tem possibilitado o uso do kDNA como um ótimo modelo para estudos de tipagem molecular do Trypanosoma cruzi. Os primeiros relatos de polimorfismo de DNA em T. cruzi datam de 1980 e foram baseados nas análises de tamanhos dos fragmentos de restrição (RFLPs) das moléculas de minicírculos do kDNA. Os padrões de restrição gerados permitiram a caracterização de diferentes cepas e clones do parasito, os quais foram agrupados em subpopulações, em função da semelhança dos perfis dos produtos de digestão do DNA de minicírculos por endonucleases de restrição. Assim, populações de parasitos apresentando padrões de restrição idênticos ou semelhantes foram denominadas esquizodemas.

As análises dos perfis de digestão do kDNA de T. cruzi revelaram uma extrema diversidade genética intra-específica, demonstrando pela primeira vez que uma única cepa do parasito podia conter dois ou mais genótipos clonais distintos, representando provavelmente clones que existem naturalmente, e que foram geneticamente isolados um do outro com o decorrer do tempo. A existência destas cepas multi-clonais foi confirmada mais tarde por vários grupos, usando diferentes abordagens. A classificação das cepas de T. cruzi em esquizodemas serviu como importante ferramenta epidemiológica para monitorar cepas específicas na natureza, assim como para o entendimento do possível papel da diversidade genética de T. cruzi na síndrome da doença.

 

Sequências conservadas e repetidas dos minicírculos do kDNA como alvo de detecção do Trypanosoma cruzi: uso no diagnóstico molecular da doença de Chagas 

Na década de 80, com a proposição da tecnologia de tipagem molecular de T. cruzi pelo perfil de restrição dos minicírculos do kDNA, tornou-se interessante elucidar a estrutura primária destas moléculas-alvo da análise de esquizodemas. Assim, através do sequenciamento de DNA de minicírculos de diferentes cepas e isolados de T. cruzi, foi demonstrado que cada molécula de aproximadamente 1.400 pares de bases (pb), encontrava-se organizada em quatro pequenas regiões de 120 pb, dispostas uma em relação à outra em ângulos de 90°, as quais apresentavam um alto nível de conservação de sequência intra-espécie. Essas regiões conservadas apresentavam-se intercaladas por regiões maiores, em torno de 330 pb, que exibiam uma extrema variabilidade de sequência entre os milhares de minicírculos que compõem a rede de kDNA (Figura 1).

 

A descoberta que os minicírculos do kDNA em T. cruzi continham segmentos repetidos (conservados) e abundantes, denominados “mini-repeats”, fez com que estas moléculas pudessem se constituir em alvos ideais para o desenvolvimento de processos moleculares de detecção e tipagem deste parasito. Podemos considerar que a identificação dos “mini-repeats” nos minicírculos de T. cruzi representou um marco, pelas perspectivas e oportunidades que abriu para novas abordagens em estudos laboratoriais, diagnósticos, clínicos e epidemiológicos em doença de Chagas.

Com o advento em 1988 do processo de amplificação gênica pela reação em cadeia da polimerase (PCR), foi possível o desenho de iniciadores ou “primers” adequados para a amplificação seletiva e específica do kDNA de T. cruzi, com o propósito de desenvolvimento de uma estratégia molecular para ser aplicada como ferramenta complementar aos testes sorológicos no diagnóstico da infecção chagásica crônica. Devido à baixa parasitemia encontrada na fase crônica da doença, tornou-se necessário a otimização de um teste baseado na PCR que apresentasse uma sensibilidade superior aos métodos parasitológicos clássicos (xenodiagnóstico, hemocultura), e de igual especificidade, que pudesse substituir o xenodiagnóstico na avaliação parasitológica direta de portadores da doença de Chagas crônicos. Neste contexto, a escolha das sequências conservadas dos minicírculos do kDNA como alvo de amplificação pela PCR foi essencial para o sucesso da aplicação do método, considerando que a rede de kDNA do parasito é composta por cerca de 10.000 a 20.000 moléculas de minicírculos, onde cada uma dessas moléculas possui quatro regiões conservadas (totalizando cerca de 40.000 a 80.000 repetições destas sequências por parasito).

Na década de 90 vários trabalhos demonstraram a extrema sensibilidade e especificidade da técnica de PCR para a detecção do T. cruzi diretamente no sangue de portadores da doença de Chagas soropositivos, revelando assim que essa técnica possuía um alto potencial para avaliação da parasitemia, em pacientes crônicos que apresentavam um reduzido número de parasitos circulantes. A maioria desses trabalhos baseou-se no uso das sequências conservadas e repetidas dos minicírculos do kDNA como alvo de amplificação pela PCR, possibilitando a detecção de até mesmo um único parasito presente em 10 mililitros de sangue. Desta forma ficou demonstrado que as sequências de minicírculos do kDNA representavam marcadores apropriados tanto no nível de espécie quanto de cepas, para a respectiva detecção ou classificação (tipagem) do T. cruzi.

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RNA

Processamento de RNA em Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi é membro da ordem Kinetoplastida, uma das linhagens eucarióticas evolutivamente mais antigas e caracterizada pela organização peculiar de seu DNA mitocondrial, e apresenta mecanismos de expressão gênica com vários aspectos incomuns quando comparados com outros eucariotos. Apesar da maioria dos principais tipos de RNA estarem presentes nesse organismo, como esperado, o rRNA 28S está dividido em seis fragmentos, o que resulta numa montagem incomum em etapas da subunidade 60S do ribossomo. Além disso, microRNAs parecem estar ausentes, com pequenos RNAs da faixa de tamanho relevante correspondendo a fragmentos de tRNA, rRNA, snRNA e snoRNA.

Processamento de RNA

Quase todos os genes de proteína deste organismo estão organizados em grupos que são coordenadamente transcritos em precursores de mRNA policistrônicos (Clayton 1992; El-Sayed et al. 2005). Uma vez que em T. cruzi, como nos demais eucariotos, somente mRNAs monocistrônicos são traduzidos, os precursores de mRNA policistrônicos devem ser processados até mRNAs individuais. Este processamento é feito através de uma combinação de trans-splicing 5’ e clivagem e poliadenilação 3’.

O trans-splicing consiste na adição, in trans, de um exon não codificante capeado chamado spliced leader (SL), ou mini-exon, à extremidade 5’ de cada região codificante presente no pré-mRNA. Este processo soluciona o problema da criação de vários mRNAs individualmente capeados a partir de um único transcrito policistrônico. O trans-splicing foi proposto quando foi verificado que todos os mRNAs de Trypanosoma brucei possuíam uma sequência comum de 39 nucleotídeos no seu terminal 5’ que não era transcrita de DNA adjacente ao gene do restante do mRNA. Posteriormente foi demonstrado que este processo está presente em todos os cinetoplastídeos, e que a sequência do SL é espécie-específica. Em termos de mecanismo o trans-splicing é bastante semelhante ao cis-splicing de outros eucariotos, e consiste na junção de duas sequências a partir de duas moléculas precursoras de RNA mediante duas reações de transesterificação (Figura 1). Em T. cruzi o SL é derivado dos primeiros 39 nucleotídeos de um RNA de 110 nucleotídeos chamado SL RNA, o qual é transcrito a partir de um grande número de genes repetidos em tandem no genoma e recebe um cap 5’ peculiar a tripanossomatídeos com estrutura cap 4, onde os quatro primeiros nucleotídeos após a 7-metil-guanosina são metilados.

Várias evidências indicam que o trans-splicing de tripanossomatídeos e o cis-splicing dos demais eucariotos são semelhantes no que diz respeito ao mecanismo: (i) sequências consenso GU-AG de junções exon-intron e intron-exon estão presentes no SL RNA e no pré-mRNA de tripanossomatídeos; (ii) um intermediário de RNA em forma de Y, contendo uma ligação fosfodiester 2’-5’ e análoga ao intermediário de RNA em forma de laço do cis-splicing, foi identificado; (iii) os snRNAs U2, U4 e U6 são essenciais ao trans-splicing; e (iv) o SL RNA é capaz de substituir funcionalmente o snRNA U1 no cis-splicing de mamíferos, enquanto que um análogo do snRNA U5 foi encontrado em T. brucei. Alguns fatores de splicing foram identificados em T. cruzi, tais como a proteína XB1, ortóloga do fator PRP31p de Saccharomyces cerevisiae e que se liga ao SL RNA, e o ortólogo do fator U2AF35.

Apesar dos cinetoplastídeos serem os únicos organismos conhecidos onde aparentemente todos os mRNAs contém o SL, a ocorrência de trans-splicing foi demonstrada em outros organismos. Caenorhabditis elegans, Ascaris spp., Schistosoma mansoni, Diplonema spp., Echinococcus multilocularis, platelmintos, cnidários, e Ciona intestinalis adicionam SLs à alguns dos seus pré-mRNAs, enquanto que a planta de tabaco e Euglena spp. utilizam o trans-splicing para combinar transcritos separados que formam a sequência codificante de algumas proteínas mitocondriais e de cloroplasto. Por outro lado, foi descrito que os genes da poli(A) polimerase de T. cruzi e T. brucei são interrompidos por um intron que é removido por cis-splicing, indicando que pelo menos alguns pré-mRNAs destes organismos são processados por cis- e trans-splicing.

Em tripanossomatídeos, trans-splicing e poliadenilação provavelmente ocorrem co-transcricionalmente, parecem estar acoplados e são determinados, em parte, por segmentos de DNA ricos em pirimidinas presentes nas regiões intergênicas. As sequências determinantes do sítio aceptor 3’ de trans-splicing são semelhantes às usadas por outros organismos para o cis-splicing: uma região de polipirimidina seguida de um dinucleotídeo AG. Em T. cruzi, análise por mutação mostrou que o sítio aceptor 3’ é escolhido selecionando-se o primeiro dinucleotídeo AG após o ponto de ramificação e região de polipirimidina, em semelhança a outros tripanossomatídeos. Por outro lado, mRNAs de tripanossomatídeos não possuem o sinal canônico de poliadenilação AAUAAA, presente 10-30 bases a 5’ do sítio de poliadenilação de mRNAs de eucariotos superiores. Em Leishmania major, poliadenilação tende a ocorrer em sítios múltiplos localizados a uma distância média de 390 bases a 5’ do sítio aceptor 3’ de trans-splicing, o que sugere que o sítio de poliadenilação é especificado pelo sítio de trans-splicing. Em T. brucei, o sítio de poliadenilação é determinado por uma região de polipirimidina seguida de AG localizada aproximadamente a 100 bases 3’ do mesmo; no entanto, apesar de se assemelhar consideravelmente com um sítio aceptor de trans-splicing, esta região se encontra a várias centenas de bases a 5’ do sítio de trans-splicing majoritário do próximo gene da unidade transcricional. Em T. cruzi, os sítios de trans-splicing e poliadenilação foram identificados em vários genes. No entanto, com exceção da caracterização de um extrato nuclear com atividade de clivagem e poliadenilação 3’, as sequências determinantes deste processo ainda não foram investigadas em detalhe neste organismo.

Vários exemplos de processamento alternativo foram descritos em T. cruzi. Sítios alternativos de trans-splicing são utilizados nos transcritos dos genes da proteína ribossômica P2 beta, histona H2A, TcRho1 e LYT1, e sítios alternativos de poliadenilação foram descritos nos genes da histona H2A e HSP10. Em alguns casos, como descrito para LYT1 e HSP10, o processamento de RNA parece ser alvo de mecanismos de regulação gênica. Uma vez que a regulação gênica em T. cruzi e demais tripanossomatídeos ocorre principalmente, se não exclusivamente, no nível pós-transcricional, a importância do estudo do processamento de RNA nestes organismos se torna evidente.

Proteínas que ligam RNA

A importância de proteínas que ligam RNA (RBPs) para a função de RNAs se torna cada vez mais evidente. Várias RBPs foram identificadas no genoma do T. cruzi, contendo os domínios bem caracterizados CCCH, RRM, Pumilio, e relacionado a SR. Exemplos incluem TcUBP-1, que liga aos mRNAs de SMUG mucinas, TcRBP40, TcRBP19, e TcPABP1, um proteína que se liga à cauda poli(A). O RNA alvo da maioria das RBPs identificadas até o momento ainda não foi determinado, o que indica a necessidade de novas pesquisas.

 

Figura 1: Trans-splicing e poliadenilação do pré-mRNA em T. cruzi. Representação esquemática do processamento do pré-mRNA. O sítio aceptor de splicing 5’ (5’ SS), o sítio aceptor 3’ (3’ SS) e o ponto de ramificação (BP) estão indicados. C, cap 5’; SL, spliced leader; Py, região de polipirimidina; pA, cauda poli(A). 1, primeira reação de transesterificação; 2, segunda reação de transesterificação; 3, clivagem e poliadenilação; 4, desramificação e degradação do intermediário em Y. Representação não está em escala.

Figura 1 – Process RNA Tcruzi TuranUermeny.

 

 

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DNA

Metabolismo de DNA em Trypanosoma cruzi: o que sabemos dos 3 Rs (replicação, reparo e recombinação)?

Carlos Machado

Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas

E-mail: crmachad@icb.ufmg

 

Todos os organismos possuem um genoma que controla o seu crescimento, sobrevivência e interação com o ambiente. Essas informações, além de terem de ser passadas de forma fidedigna entre as gerações, não podem estar bloqueadas ou conter erros. Esse arsenal de informações esta contido na seqüência do DNA, o qual está exposto a uma série de fatores endógenos e exógenos que são capazes de causar danos a essa molécula. Portanto, para que um organismo seja capaz de sobreviver e multiplicar, é fundamental que ele seja capaz de replicar a sua informação de forma fiel e evitar que danos nessa informação gerem algum tipo de bloqueio que pode levar à morte, ou erro na informação que pode levar a mutação.

O metabolismo do DNA está conservado em todos os organismos estudados até o momento e pode ser inserido nos 3 Rs do DNA, ou seja, replicação, reparo e recombinação. O estudo dessa área em tripanossomatídeos é um campo promissor que com as informações advindas do projeto genoma tem trazido informações importantes sobre a biologia desse organismo. Nesse texto, iremos discutir alguns aspectos da replicação, reparo e recombinação do Trypanosoma cruzi.

 

Replicação do DNA

Os parasitos requerem um mecanismo de replicação do DNA que seja capaz de duplicar um genoma contendo milhares de pares de bases e que esse processo seja controlado para ocorrer apenas uma vez a cada divisão celular. No T. cruzi, a fase S (momento em que ocorre a replicação do DNA) ocorre por 2,4 h em um ciclo celular de 24 h. O processo de replicação ocorre de maneira ordenada em que primeiro temos o reconhecimento da origem de replicação, depois é realizada a iniciação e, por fim, a replicação semiconservativa do DNA.

Apesar da seqüência de origem não ser bem estabelecida em todos os eucariotos, as proteínas que reconhecem essa seqüência são. Seis proteínas ORCs reconhecem a origem e recrutam a Cdc6, o complexo formado, então, é capaz de associar ao DNA as proteínas MCM (proteínas de manutenção dos cromossomos) que têm atividade de helicase e permite o acesso da maquinaria de replicação ao DNA. O genoma dos tripanossomatídeos revela que nesse organismo a maquinaria de iniciação da replicação diverge em alguns pontos dos outros eucariotos. A principal diferença é que só foi verificada uma única proteína ORC e esta é mais similar às de arqueabactérias. A maquinaria de replicação, apesar de não apresentar todas as proteínas de controle verificadas em outros organismos, apresenta todos os genes envolvidos na replicação do DNA, tais como: a DNA polimerase alfa, responsável pela síntese do iniciador; a proteína RFC, responsável por trazer a DNA polimerase alfa até o DNA; as DNA polimerases delta e epsilon que são as polimerases replicativas; além da proteína PCNA que é fundamental para a processividade das DNAs polimerases.

Os tripanossomatídeos apresentam algumas propriedades biológicas que os distinguem de outros eucariotos, uma das diferenças mais marcantes é o DNA concatenado presente no cinetoplasto. O kDNA concatenado é o DNA mitocondrial mais elaborado presente na natureza e a complexidade dessa estrutura parece requerer um processo de replicação muito mais requintado que dos outros eucariotos. Em todos os eucariotos estudados até o momento, apenas uma DNA polimerase (DNA polimerase gama) esta envolvida no processo de replicação. Em tripanossomatídeos, existem diferentes polimerases que se localizam no cinetoplasto e que podem estar associadas com a replicação do material genético dessa organela. Nesse organismo, encontramos quatro DNA polimerases I (A, B, C, e D) que apesar de pertencerem a mesma família da DNA polimerase gama, apresentam uma maior similaridade com a DNA polimerase I de Escherichia coli. Também são encontradas no cinetoplasto, DNA polimerases que são encontradas no núcleo em outros eucariotos. Igual a Trypanosoma brucei, temos verificado em estudos realizados em nosso laboratório que a DNA polimerase beta, que normalmente é encontrada no núcleo participando de vias de reparo de DNA, está presente no cinetoplasto de T. cruzi. Também verificamos que a proteína codificada pela duplicação desse gene, designada DNA polimerase beta-PAK, também está localizada no cinetoplasto tanto em T. brucei quanto em T. cruzi (dados de nosso laboratório ainda não publicados). Curiosamente, uma outra DNA polimerase, a kappa, envolvida em síntese trans-lesão do DNA nuclear também foi localizada no cinetoplasto de T. cruzi (dados ainda não publicados). Será que essas sete diferentes DNA polimerases estão todas envolvidas no processo de replicação do kDNA? Será que as DNA polimerases que em outros organismos estão direcionadas para o núcleo, ganharam um sinal de direcionamento para mitocôndria em tripanossomatídeos ou perderam esse sinal nos outros eucariotos? Será que essas DNA polimerases também vão para o núcleo? Essas são algumas de várias perguntas que ainda faltam ser respondidas sobre a replicação do DNA em tripanossomatídeos.

 

Reparo e recombinação do DNA

A instabilidade genômica gerada durante a replicação e pela grande variedade de agentes que danificam o DNA seria um sério problema para a célula se não fosse pelo sistema de reparo. Várias vias de reparo envolvendo diversas proteínas atua nos mais variados tipos de dano ao DNA. Esses mecanismos de reparo podem ser classificados em vias distintas, mas não totalmente independentes. Algumas enzimas participam exclusivamente de certas vias e agem em substratos específicos, enquanto outras são redundantes. Sobreposições entre diferentes vias também são comuns. Aspectos gerais de cada via de reparo, assim como o que se sabe em T. cruzi, estão descritos a seguir.

 

Reparo direto da lesão

A via de reversão direta da lesão envolve fotoliases e alquiltransferases, enzimas que atuam respectivamente sobre dímeros de pirimidina (causados pela radiação ultra-violeta) e bases alquiladas, como O⁶metilguanina. Essa é a via de reparo mais simples descrita até o momento. A base quimicamente modificada é reparada diretamente, sem que seja necessária à sua remoção do DNA. No genoma de T. cruzi não se verificou nenhum gene com similaridade a fotoliase, mas existem genes com similaridade com alquiltransferases.

 

 Síntese trans-lesão

 A síntese translesão (TLS – TransLesion Synthesis) foi proposta como uma via de reparo alternativa por Kunkel e colaboradores. Participam dessa via polimerases, como DNA polimerase kappa e eta, que não possuem atividade exonucleásica e são capazes de sintetizar DNA através de uma lesão. Dentre as lesões processadas por essas polimerases estão os dímeros de pirimidina e 8-oxoG. Dados de nosso laboratório mostram que as DNA polimerases kappa e eta de T. cruzi também são capazes de realizar a síntese translesão.

 

Recombinação e o NH

O reparo por recombinação lida com quebras de fita dupla (DSB – Double Strand Break) no DNA. Duas vias independentes atuam no reparo de DSB. O NHEJ (Non-Homologous End-Joining ou ligação de extremidades não coesivas) é o processo utilizado com maior freqüência em mamíferos. Nessa via de reparo, as extremidades do cromossomo que sofreu quebra dupla são justapostas e religadas, com a possível perda de um ou dois nucleotídeos no local da ligação. Em outros organismos, quebras duplas são normalmente reparadas por recombinação homóloga, utilizando a informação contida no cromossomo homólogo não danificado. O NHEJ é uma forma rápida de reparo, porém tem maior tendência a erro, ao contrário da recombinação homóloga. No genoma do T. cruzi, vários genes envolvidos na NHEJ não foram encontrados o que pode sinalizar que essa via não está presente nesse organismo. Por outro lado, tem se verificado que o processo de recombinação homóloga em T. cruzi é bastante intenso e está relacionado com a alta resistência à radiação ionizante apresentada por esse organismo. Esse intenso processo de recombinação também pode ser a explicação para alta homozigose que é encontrado no T. cruzi, o que não era de se esperar em um organismo de reprodução clonal.

 

Reparo por excisão de base

O BER (Base Excision Repair ou reparo de excisão de bases) lida com danos a bases individuais, como oxidação, metilação, depurinação e deaminação. Essa via envolve glicosilases que reconhecem e removem tipos específicos de bases alteradas através de hidrólise, gerando um sítio abásico que é então preenchido com a base correta. Uma DNA glicosilase e uma AP endonuclease de T. cruzi já foram caracterizadas bioquimicamente. A DNA polimerase beta que em humanos esta envolvida no processo do BER, como descrito acima, está no cinetoplasto de T. cruzi. Portanto, ou uma outra DNA polimerase está envolvida nesse processo ou a DNA polimerase beta também está presente no núcleo, mas em quantidades não detectáveis pelos métodos atuais.

 

Reparo por excisão de nucleotídeos

O NER (Nucleotide Excision Repair – reparo de excisão de nucleotídeos) corrige lesões causadoras de distorções na hélice do DNA, como a produzida por dímeros de pirimidina formados após exposição à luz UV, removendo um fragmento de DNA de aproximadamente 30 nucleotídeos. O NER pode ser dividido em duas sub-vias: TCR (Transcription-Coupled Repair) e GGR (Global Genomic Repair). O TCR atua na fita transcrita do DNA, após o bloqueio da transcrição pela RNA polimerase II. Já o GGR repara tanto a fita transcrita quanto a não transcrita. Genes relacionados a essa via estão presentes no T. cruzi, com exceção do gene XPA, o que também é verificado em Plasmodium. Uma questão importante a se verificar é qual o papel do TCR em T. cruzi, uma vez que, acredita-se, quase todo o genoma desse organismo está sendo transcrito.

 

Reparo de erro de pareamento

Por sua vez, o MMR (Mismatch Repair ou reparo de erros de pareamento) é uma via de reparo que corrige bases mal pareadas no DNA. Esse processo consiste no reconhecimento da base mal pareada, excisão do segmento de DNA que contém o erro e a síntese da região removida utilizando a fita parental como molde. O MMR é extremamente importante para assegurar a manutenção de estabilidade do genoma após a replicação do DNA, aumentando sua fidelidade em cerca de 1000 vezes. Defeitos em pelo menos cinco genes envolvidos no MMR estão associados com HNPCC (Human Non Poliposis Colon Cancer ou câncer de cólon não polipóide) em humanos. Todos os genes do MMR estão presentes em T. cruzi, sendo que o gene MSH2 já foi caracterizado. Evidências sugerem que a via do MMR apresenta diferença de eficiência nas diferentes cepas de T. cruzi, sendo que as cepas do grupo T. cruzi I apresentariam um MMR mais eficiente que cepas do grupo II. Essa diferença pode estar associada com a maior diversidade encontrada nas cepas do T. cruzi II. Esse mecanismo de geração de variabilidade genética encontra um paralelo em mecanismos já descritos em diferentes bactérias.

Apesar dos estudos sobre o metabolismo do DNA do T. cruzi ainda estarem no início, os dados já obtidos mostram a importância do mesmo para o entendimento da biologia do T. cruzi, assim como, poderão nos ajudar a compreender como esses mecanismos evoluíram nos diferentes organismos.

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DTUs

Genótipos de Trypanosoma cruzi e cenários clínico da doença de Chagas

Alejandro Gabriel Schijman, Ph.D

Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular –INGEBI- CONICET. Buenos Aires, Argentina.

e-mail de contacto: schijman@dna.uba.ar

 

As formas clínicas e a gravidade da doença de Chagas foram atribuídas a uma série de interações entre a complexidade do parasito Trypanosoma cruzi, o hospedeiro e fatores ambientais. A espécie T. cruzi apresenta uma estrutura clonal com eventos de recombinação gênica, que foi a fonte das características de heterogeneidade, policlonal e híbrida de cepas  existentes. Populações naturais podem ser classificadas em pelo menos 7 “discrete typing units” (DTUs), denominadas TcI a TcVI e Tcbat. O termo ‘‘discrete typing unit’’ descreve grupos de estoques de parasitos geneticamente próximo entre eles do que em relação a outro qualquer estoque. Estas DTUs são identificáveis por marcadores moleculares específico, mostram distribuições geográficas, teor de DNA e dosagem de genes diversos. Diferentes graus de diversidade também ocorrem dentro de cada DTU. Importante é o fato que esta ampla diversidade já ter sido reconhecida pelo Dr. Carlos Chagas quando da descoberta da doença. De fato, ele descreveu diferentes variantes morfológicas observadas por exame microscópico de parasitos sanguíneos, construindo as bases para agrupar isolados naturais dentro da espécie  T. cruzi e classificar estes isolados utilizando diferentes abordagens de tipagem.  As tentativas taxonômicas iniciais incluíam os tipos imunológicos por Nussenszweig e colaboradores (1963) e o trabalho pioneiro de Andrade (1974), que associou combinações específicas de  características morfológicas e comportamentais  do parasito. Virulência, patogenicidade, propriedades imunológicas, teor de DNA, cariótipos moleculares, polimorfismos genômicos, susceptibilidade a drogas tripanocidas, são algumas das características associadas à estrutura populacional de T. cruzi. Multilocus sequence typing (MLST) é atulamente o padrão ouro para estudos populacionais de  T. cruzi, permitindo a identificação de diversidades de relações  inter-DTU e intra-DTU, como também a ocorrência de eventos de recombinação.

Devido à sua distribuição geográfica, a diversidade genética de T. cruzi deve ser levada em conta no desenvolvimento de testes diagnóstico para uso mundial, e qualquer novo teste deve ser validado com cepas representantes de todas as DTUs. Na realidade, testes diagnósticos baseados em alguns alvos moleculares utilizando antígenos recombinantes e amplificação de DNA são polimórficos e apresentam expressão gênica diferencial em cepas pertencentes a diferentes DTUs e em alguns casos em cepas da mesma DTU. De todas as sequências genômicas do parasito inteiro em bases de dados públicas, somente três das seis DTUs estão disponíveis, DTUs I, II e VI, que são principalmente relacionadas à infecção humana. Esta informação ainda não é suficiente pra o completo entendimento da história evolucionária de T. cruzi.  Diferentes grupos de pesquisa propuseram quatro principais modelos para explicar o número de eventos de hibridização e a troca gênica através da evolução do parasito.  De um modo geral, estes grupos concordam que as duas as DTUs híbridas,  TcV e TcVI, são originárias das cepas parentais TcII e TcIII, mas discordam sobre qual seria a DTU ancestral e qual no número de eventos de hibridização que deram origem às cepa existentes. A maioria dos modelos propostos foram baseados em apenas alguns genes, e as diferenças entre estes modelos poderiam ser tendenciosas devido a diferenças nas taxas de evolução dos genes escolhidos para análise. Assim, parece que a diversificação do T. cruzi nas linhagens atualmente existentes foi recente.

Um melhor entendimento das relações entre linhagens distintas é crucial para o estabelecimento de estratégias efetivas de controle. Mais de 6.300 identificações de DTUs foram analisadas com base nas origens geográfica e de hospedeiro. TcI, com o seu alto polimorfismo intragenético intra-DTU e ampla distribuição geográfica prevaleceu na nas amostras como um todo em ambos os ciclos, silvestre e doméstico. TcII foi pouco frequente, ausente ou rara nas Américas do Norte e Central, e mais frequentemente identificada em ciclos domésticos. Esta linhagem apresenta uma baixa diversidade genética e provavelmente encontrou abrigo em certas espécies de mamíferos. TcIII e TcIV foram raramente encontradas, com substancial diversidade genética, mais associadas a ambientes silvestres, porém também detectadas em infecções humanas. TcV e TcVI estão claramente associadas a ciclos de transmissão domésticos.  Tc bat é uma linhagem monofilética prevalente no Brasil, Panamá e Colômbia. Esta linhagem foi recentemente encontrada em uma criança de 5 anos de idade em uma área de floresta no noroeste da Colômbia.

A diversidade de hospedeiro e condições ambientais certamente explicam a manutenção da diversidade do parasito e a emergência de novas variantes por seleção natural. Assim, a distribuição da DTUs até o momento reportada é uma representação temporária, que inevitavelmente irá evoluir com o tempo, assim que mais amostras se tornem disponíveis devido a mudanças ambientais e climáticas em progresso.

Existe muita especulação sobre se esta variabilidade está associada com o prognóstico da doença. Sendo a doença de Chagas um evento relativamente novo na história evolucionária de T. cruzi, pode se esperar que diferentes populações parasitárias possam apresentar diferentes taxas de infectividade, virulência e capacidade de desenvolvimento da doença em humanos. Atualmente, é aceito que todas as DTUs são infectivas para humanos e causas a doença de Chagas.

Em 1998, os Drs. Andrea Macedo e Sergio Pena propuseram um modelo clonal histotrópico, pelo qual diferentes clones do parasito apresentavam diferentes tropismos teciduais.  Como base em evidências de uma associação entre persistência do parasito e dano tissular, como observado utilizando-se abordagens moleculares, o modelo leva ao pressuposto do fato que diferentes tropismos tissulares de genótipos do parasita poderia ser a etapa chave no desenvolvimento de diferentes formas clínicas. De qualquer modo, a correlação entre a apresentação clínica da doença de Chagas crônica com DTUs foi incidental, não provada, sendo dificultada pela ocorrência de infecções mistas, sequestro de DTUs em tecidos e interações complexas como a resposta imune do hospedeiro. Além disso, demonstrações de associações é difícil devido à proporção de pacientes assintomáticos que já poderia apresentar alterações nos órgãos, ainda crípticas ao exame clínico e somente detectadas por métodos diagnóstico mais sofisticados. Estudos realizados com amostras de sangue periférico não necessariamente revelam o complete e verdadeiro universo de genótipos responsável pelas manifestações da doença, pois clones podem ser agrupados em tecidos, com diferentes taxas de proliferação, existência de formas dormentes, mostrando baixa carga sanguínea e impedindo sua detecção. Estudos baseados no uso de culturas in vitro e modelos animais também são limitados pelo  fato que somente os clones mais competitivos, devido a uma mais rápida taxa de divisão ou uma maior abundância da amostra original, seria detectado em detrimento de outros que poderiam ser, aqueles causadores da doença.

Apesar destas limitações, a reação em cadeia da polimerase (PCR) abriu novas possibilidades como um instrumento molecular para identificação das DTUs de T. cruzi DTUs, e para a variabilidade entro de cada DTU diretamente em amostras biológicas, utilizando diferentes estratégias downstream, como polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição, curvas de dissociação em alta resolução, polimorfismos em loci de microsatélites e sequenciamento. Sondas multiplex TaqMan baseadas em procedimentos Real-Time PCR foram também desenvolvidas. Além disso, ensaios sorológicos baseados em antígenos pequenos de superfície de tripomastigotas (TSSA) capazes de discriminar uma resposta humoral contra TcI a TcII, TcV ou Tc VI foram relatados. A informação disponível sugere que as cepas do parasito detectadas em pacientes, independentemente de sua apresentação clínica, refletem a principal DTU circulante nos ciclos de transmissão domésticos em uma dada região.  Isto também é verdadeiro para a doença de Chagas congênita; amostras de recén-nascidos congenitamente infectados mostraram que estes foram infectados pela DTU presente nas mães e na mesma proporção que na população em geral. Mesmo assim, ao nível infra-DTU, cepas com diferentes tropismos e infectividades em tecidos placentários foram também reportados.

Em surtos transmitidos por via oral, estão principalmente envolvidas as cepas silvestres. Em surtos orais na Venezuela, Colômbia, a Guiana Francesa TcI prevalece e causa manifestações de cardiopatia aguda e Tc IV foi detectado em surtos orais na Venezuela e no Amazonas boliviano e brasileiro, enquanto TcII e TcVI também foram detectados em Santa Catarina. Foi demonstrado em modelos murinos de infecção digestiva, que diferentes cepas levam a diferentes graus de infectividade.

A cardiomiopatia chagásica e as anormalidades no ECG ocorrem em todas as regiões endêmicas; estudos realizados na Argentina e na Bolívia, que coletaram mais de 300 amostras, permitiram associar infecção crônica a populações pertencentes a TcII, TcV ou TcVI, independentemente da manifestação clínica. Isso também foi encontrado para os isolados de TcII de pacientes crônicos do sudeste brasileiro. Destaca-se, porém, que em pacientes com cardiopatia chagásica crônica que receberam transplante cardíaco, TcI pôde ser detectado em tecidos de explantes cardíacos, observando em alguns pacientes, misturas de DTUs, subgenótipos de TcI e clones de uma mesma DTU, com distribuição diversa entre tecidos e sangue.  È interesante observar, que a análise multivariada mostrou uma correlação entre uma maior dilatação cardíaca em corações infectados com TcI em relação a outras DTUs. A TcII foi identificada em pacientes cardiopatas de Pernambuco, Bahia e Minas Gerais, mas também em pacientes assintomáticos e em pacientes com megaesôfago nas mesmas regiões.

Megasíndromes digestivas são comuns no Cone Sul e raras no norte da Amazônia. Esta forma da doença foi associada a TcII e TcV na Bolívia e a TcII e TcVI no Brasil. Desta forma, parece que TcI não causa megasíndromes digestivas, ou ainda não foi encontrada em tecidos digestivos.

Tc VI foi encontrada em indivíduos assintomáticos da Bahia até o Rio Grande do Sul em outras regiões do Cone Sul. Em pacientes chagásicos cardíacos transplantados, a reativação ocorre em uma parte de casos. Nestes com aumento da carga parasitária no sangue e episódios de paniculite, foram detectados diferentes DTUs, a saber, TcI, TcV e TcVI. A coexistência de clones de parasitas pertencentes a diferentes DTUs também foi observada em casos de Chagas-AIDs; sendo detectadas diferentes DTUs no sangue e fluido cérebro espinhal (CSF) ou em material de biópsia do cérebro.

Infecções mistas e reinfecções têm o potencial de exacerbar a progressão da doença e, assim, afetar o manejo clínico de pacientes com doença de Chagas.

Em modelos murinos infectados com uma mistura de isolados, o parasito pode ser encontrado em um grande número de órgãos, uma infecção mais disseminada pode ocorrer, apesar de não haver evidências de que infecções mistas tem um maior efeito patológico.  Por outro lado, re-infecções tem efeitos importantes na sobrevida do hospedeiro e na progressão da doença. Isto confirma a pesquisa mostrando mortes espontâneas após reinfecção de camundongos, e maior gravidade da doença em pacientes que moram em áreas rurais endêmicas com transmissão ativa.

A progressão da doença de Chagas (DC) varia significantemente entre diferentes hospedeiros, sendo afetada por fatores múltiplos. Foi observado em modelos murinos que a mesma DTU pode apresentar histotropismos diferentes a depender do genótipo MHC do hospedeiro. Estudos com pacientes do Brasil, Venezuela e México mostraram que alguns alelos de histocompatibilidade diferem entre forma indeterminada e cardiopatas.

Também polimorfismos de SNP em genes placentários humanos têm sido associados à susceptibilidade de aquisição da infecção congênita. Assim, a interrelação entre o parasito e a genética do hospedeiro deve ter um papel importante na definição da patogênese da doença de Chagas e, consequentemente, a pesquisa científica deve se concentrar na compreensão dessa interação parasita-hospedeiro.

 

Diversidade de T. cruzi e susceptibilidade a drogas

Testes in vitro utilizando um painel de cepas e clones que representam a diversidade genética do T. cruzi parecem estar ausentes na maioria dos programas de descoberta de drogas para doença de Chagas. Após uma reunião de especialistas no Rio de Janeiro em 2012, foi recomendado que, uma vez que candidatos promissores a medicamentos fossem identificados, eles deveriam ser testados para uma atividade mais ampla contra dois ou três representantes de cada DTU, como triagem secundária. Prioridade deve ser dada às DTUs mais frequentemente associadas à infecção humana (TcI_DOM, TcII, TcV e TcVI), e preferencialmente com diversas taxas de replicação, pois esse parâmetro pode impactar a resposta a drogas, especialmente a análogos de benznidazol ou nifurtimox. Uma ampla lista de cepas relata suscetibilidade e resistência natural a estas duas drogas.

Embora a avaliação da atividade de drogas in vitro contra membros de diferentes DTUs não garanta o sucesso de drogas em humanos, atividades divergentes entre cepas podem indicar a probabilidade de falha. Assim, a triagem utilizando várias linhagens de parasitas forneceria melhores bases para decisões sobre que compostos deveriam e não ser desenvolvidos ou se seria necessário seguir na caracterização da atividade antiparasitária de um composto antes que prosseguir para outras etapas de desenvolvimento. Outra vantagem da realização de ensaios in vitro é que eles podem permitir uma avaliação mais direta da resistência “natural” de uma cepa/clone a um composto, já que eles apresentam menos variáveis do que modelos in vivo.

A resistência natural a benznidazol e nifurtimox, verificada in vivo e in vitro para alguns estoques do parasito não foram associadas com qualquer DTU em particular, e não justificaram as marcantes diferenças observada na eficácia anti-parasito de ambas as drogas nas fases aguda e crônica da doença de Chagas, mas este pode não ser o caso de outros compostos.