Hospedeiro Invertebrado
Patrícia Azambuja
Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: azambuja@ioc.fiocruz.br
Eloi S. Garcia
Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos, Instituto Oswaldo Cruz/Fiocruz
E-mail: egarcia@fiocruz.br
O Trypanosoma cruzi infecta em condições naturais mais de 100 espécies de mamíferos de diferentes ordens. O parasito na natureza existe em diferentes populações de hospedeiros vertebrados tais como seres humanos, animais silvestres e animais domésticos, e os invertebrados, a exemplo dos insetos vetores. T. cruzi possui variações morfológicas e funcionais, alternando entre estágios que sofrem divisão binária e as formas não replicativas e infectantes. Como formas replicativas estão incluídas os epimastigotas presentes no tubo digestivo do inseto vetor e amastigotas observados no interior das células de mamíferos. As formas não replicativas e infectantes, os tripomastigotas metacíclicos, são encontrados nas fezes e urina do inseto vetor e os tripomastigotas circulantes no sangue de mamíferos.
Durante a fase no hospedeiro invertebrado, o T. cruzi se transforma em epimastigotas e então, no intestino posterior, diferenciam em tripomastigotas metacíclicos (um processo conhecido como metaciclogênese) os quais, eliminados pelas fezes e urina do inseto vetor, são capazes de infectar o hospedeiro vertebrado. O parasita não penetra a pele intacta, somente infectando o hospedeiro via mucosa ou ferimentos na pele. Nos mamíferos, os parasitos se desenvolvem no interior das células sendo liberados no sangue circulante após as células do hospedeiro se romper. Inúmeros fatores podem influenciar o desenvolvimento de T. cruzi no inseto vetor. Alguns deles foram primeiramente descritos por Carlos Chagas (1909) e Emanuel Dias (1934). No entanto, a complexidade da interação T. cruzi–inseto vetor foi somente revisada mais recentemente. Durante a alimentação do inseto, as formas tripomastigotas que se encontram no sangue do hospedeiro vertebrado infectado, são ingeridas pelos insetos. Alguns dias após a alimentação do inseto, os parasitas se transformam em epimastigotas e esferomastigotas. Uma vez a infecção seja estabelecida no estômago do inseto vetor, as formas epimastigotas do parasito se dividem repetidamente por divisão binária e podem aderir às membranas perimicrovilares das células intestinais. Em grande número, os epimastigotas se ligam à cutícula retal, se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos podendo assim ambas as formas, diferenciadas ou não, serem eliminadas pelas fezes e urina.
O estabelecimento da infecção pelo T. cruzi do tubo digestivo do inseto-vetor é dependente e regulado por fatores fisiológicos e bioquímicos do inseto vetor. Em nosso laboratório foram desenvolvidos bioensaios para avaliação de uma variedade de fatores que influenciam no desenvolvimento do parasito, tais como (i) das alterações ultraestruturais das células epiteliais do intestino médio, (ii) dos fatores líticos, (iii) das enzimas digestivas e (iv) da fisiologia hormonal do desenvolvimento do inseto, como recentemente revisto por Garcia e colaboradores.
Após a ingestão do sangue infectado, na região anterior e posterior do intestino médio (estômago e intestino, respectivamente), os parasitos se confrontam com componentes existentes nestes compartimentos digestivos. Estes incluem os fatores hemolíticos, peptídeos derivados da cadeia α D-globina, lisozimas, defensinas, sistema profenoloxidase, NO e lectinas etc; os quais podem modular a dinâmica da multiplicação e diferenciação do T. cruzi no tubo digestivo do inseto vetor e ilustrar a complexidade dos mecanismos envolvidos na interação com o T. cruzi.
Pereira e colaboradores reportaram lectinas no tubo digestivo e hemolinfa de R. prolixus e sugeriram que estas moléculas poderiam estar envolvidas no desenvolvimento do T. cruzi no inseto vetor. Mello e colaboradores demonstraram diferenças no desenvolvimento de três cepas de T. cruzi no intestino de R. prolixus e relacionaram a infectividade destes parasitos com a habilidade do extrato do tubo digestivo aglutinar in vitro os flagelados. Assim, lectinas aglutinaram o clone Dm28c do T. cruzi, o qual apresentava o máximo nível de infectividade, enquanto, ao contrário, a cepa Y do parasito, a qual não era aglutinada, era lisada no tubo digestivo do inseto vetor.
Frainderaich e colaboradores demonstraram que a metaciclogênese do T. cruzi era induzida in vitro por peptídeos derivados a α-D-globina. Garcia e colaboradores estudaram, em R. prolixus in vivo, os efeitos da hemoglobina e peptídios sintéticos correspondentes as regiões fragmentadas da sequência da alfa-D-globina sobre o desenvolvimento e transformação de epimastigotas de T. cruzi em tripomastigotas metacíclicos. Esta diferenciação no tubo digestivo de inseto ocorria quando hemoglobina e os peptídios sintéticos correspondentes aos resíduos 30-49 e 35-73 da alfa-D-globina eram adicionados na dieta de plasma. Entretanto, o peptídio sintético 41-73 não induziu a diferenciação de epimastigotas para tripomastigotas metacíclicos, mesmo na presença dos dois primeiros peptídios. A hemoglobina demonstrou ser um componente importante do sangue para o desenvolvimento dos parasitos. Estes resultados identificaram um mecanismo molecular incomum, o qual modula a dinâmica de transformação de epimastigotas para tripomastigotas metacíclicos no tubo digestivo do inseto vetor.
No que se referem às enzimas digestivas, recentes experimentos demonstraram que insetos infectados com T. cruzi tiveram aumentado à atividade de catepsina D. Entretanto, a alimentação de R. prolixus com o inibidor de proteinase SH-dependente não teve efeito sobre a infecção do inseto vetor. Ursic-Bedoya e Lowernberger revelaram que o nível de transcrição de catepsina B não variava quando se comparava inseto vetor infectado e não infectado.
Um dos processos importantes da interação fisiológica do T. cruzi e seu inseto vetor são as aderências do parasito na superfície das células intestinais. Nogueira e colaboradores utilizando-se de análise em videomicroscópio demonstraram que as formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi se movem na direção e sentido da superfície das células epiteliais do epitélio intestinal, mas enquanto as formas tripomastigotas não aderem ao epitélio, os epimastigotas aderem no estômago e no intestino. Aparentemente este processo de reconhecimento envolve moléculas de fosfolipídeos de glicoinositol (GIPLs) que se encontram abundantemente na superfície de epimastigotas. A ligação de GIPLs purificadas à superfície das células do intestino posterior através a exposição à imunofluorescência indicou que estas moléculas são um dos componentes envolvidos na adesão de T. cruzi no intestino do inseto, como revisto por Nogueira e colaboradores. O mesmo grupo demonstrou que proteínas hidrofóbicas localizadas na superfície de epimastigotas ligam-se a glicoproteínas das membranas perimicrovilares intestinais. A inibição de um gene envolvido a síntese de glicoproteína do T. cruzi, resultou na não aderência do flagelo do parasito no intestino e diminuiu a população de parasitos no inseto vetor.
Um enfoque para inibir as interações entre T. cruzi e o inseto vetor foi o uso de bactéria simbiótica transgênica que atacava diretamente o parasito. Rhodococcus rhodnii, um simbionte de R. prolixus, pode ser geneticamente modificado pela inserção do gene da cecropina A, um peptídeo antimicrobiano induzido pela resposta imunológica humoral de Hyalophora cecropia, capaz de destruir bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Este composto produzido pelo simbionte transformado reduziu drasticamente o número de T. cruzi no tubo digestivo do inseto vetor e apresentando, portanto, um enorme potencial para reduzir a competência vetorial.
Recentemente, Azambuja e colaboradores demonstraram que bactérias presentes no tubo digestivo de R. prolixus poderiam lisar eritrócitos e também diminuir a infecção pelo T. cruzi. Os autores isolaram a bactéria e identificaram como sendo Serratia marcescens biotype A1a, produtora do pigmento prodigiosina. Aparentemente, a lise do parasito depende de receptores dependentes de manose. A investigação sobre bactérias presentes no trato digestivo do inseto vetor poderá identificar ferramentas para bloquear o desenvolvimento do parasito no inseto vetor.
Resultados interessantes sobre a interação T. cruzi–insetos vetores foram obtidos das investigações realizadas com o composto azadiractina, um inibidor de crescimento de insetos, obtidos da planta Azadirachta indica, que interfere fortemente na regulação neuroendócrina do inseto. Esta droga administrada via oral, antes, durante ou mesmo após a infecção com T. cruzi, não somente interfere no desenvolvimento do inseto, mas também no estabelecimento da infecção parasitária no tubo digestivo de diferentes espécies de triatomíneos.
Quando larvas de R. prolixus foram decapitadas ou tratadas com azadiractina, parasitas na forma epimastigota foram incapazes de aderir ao epitélio do intestino médio do inseto). A terapia do inseto com ecdisona e o implante de cabeça normal nos insetos tratados com azadiractina, reverteram o processo de adesão e desenvolvimento do parasito, como revisto por Garcia e colaboradores. Os insetos que receberam a droga ou foram decapitados demonstraram uma desorganização nas membranas perimicrovilares das células epiteliais do intestino e indicaram que a via do hormônio protorácicotrópico, hormônio estimulador da síntese de ecdisona, está envolvida no processo de desenvolvimento de T. cruzi em seu inseto vetor.
Hospedeiro Vertebrado
Wanderley de Souza e Emile S. Barrias
Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
E-mail: wsouza@biof.ufrj.br
O ciclo no hospedeiro vertebrado pode ocorrer em diferentes espécies de mamíferos sendo o homem o hospedeiro definitivo mais relevante. Atualmente há evidências de que cães, gatos, roedores comensais e cobaias domesticadas são capazes de manter T. cruzi na ausência de qualquer outra espécie hospedeira. Eles desempenham papéis fundamentais como amplificação de hospedeiros e fontes de T. cruzi em muitos ciclos de transmissão peri doméstica cobrindo uma ampla diversidade de ecoregiões, ecotopes e espécies de triatomíneos: nenhum outro animal doméstico desempenha esse papel. Os cães cumprem os atributos desejáveis das sentinelas naturais e, às vezes, são um ponto de entrada de cepas de parasitas silvestres (Gurtler e Cardinal, 2015). O primeiro contato com o hospedeiro vertebrado com o T. cruzi em uma infecção vetorial é com as formas tripomastigotas metacíclicas que são eliminadas pelo inseto vetor e entram em contato com mucosas ou regiões lesadas da pele desses hospedeiros. Estas formas são altamente infectantes, podendo invadir os primeiros tipos celulares que encontram, que podem ser macrófagos, fibroblastos ou células epiteliais, entre outras. Ao invadir estas células usando os mecanismos descritos nos itens abaixo, ocorre proliferação intracelular e liberação de formas tripomastigotas, bem como algumas formas intermediárias e amastigotas (estas últimas em menor proporção) no espaço intercelular. Estas formas podem invadir novas células localizadas no sítio de infecção, mas podem atingir a corrente circulatória e atingir todos os tecidos do hospedeiro, onde vão invadir os mais diferentes tipos celulares. Não se deve esperar um comportamento homogêneo do Trypanosoma cruzi. Realmente, a cinética do processo descrito acima, assim como os tecidos mais infectados vão variar de acordo com a cepa do T. cruzi e o animal infectado. Em alguns casos a infecção é rápida e em outros casos só será detectada muito tempo após a infecção inicial. Isto porque, a população de T. cruzi que ocorre naturalmente é composta por um conjunto altamente heterogêneo de cepas com variação intra-espécies marcantes e exibindo características biológicas abrangentes como a morfologia distinta, taxa de crescimento, curvas de parasitemia, virulência, sensibilidade a drogas, perfil antigênico, diferenciação (metaciclogênese) e tropismo tecidual. Essa variabilidade pode explicar a ampla patogênese observada nas infecções por T. cruzi (Buscaglia e DiNoia, 2003).
A observação de formas tripomastigotas no sangue de animais infectados mostrou que nem todas são idênticas entre si, o que indica a existência de dimorfismo, ou mesmo de poliformismo, em T. cruzi, caracterizado pela presença de formas tripomastigotas largas, finas e intermediárias, assim como descrito para os tripanossomos africanos. As interpretações para este fato tem sido as mais variadas, inclusive como sendo uma indicação de dimorfismo sexual. Podemos encontrar cepas que apresentam um predomínio de formas delgadas, como é, por exemplo, o caso da cepa Y. Já em outras, como a cepa CL, predominam as formas largas. Brener e colaboradores realizaram vários estudos para esclarecer as possíveis diferenças entre ambas as formas. Por exemplo, verificaram que, em algumas populações, havia um predomínio das formas delgadas durante todo o curso da infecção experimental em camundongos. Em algumas cepas, na medida em que a infecção se prolongava, as formas largas passavam a predominar. Um conjunto de observações levou este grupo a considerar que as formas delgadas desaparecem rapidamente da circulação para cumprir um ciclo intracelular enquanto que as formas largas permanecem na circulação. Aparentemente estas formas seriam menos infectantes e mais adaptadas ao desenvolvimento no vetor. Um número significativo de estudos foi feito comparando tripomastigotas da cepa Y e CL quanto à infectividade in vivo e in vitro, capacidade de diferenciação in vitro, susceptibilidade à lise mediada por complemento e presença de anticorpos na superfície. Recentemente, através de análise por trasncriptoma de uma cepa infectiva (CL Brener) e uma cepa não infecciosa em modelos in vivo (CL-14bservou-se uma grande diferença na expressão gênica entre tripomastigotas e amastigotas intracelulares. Relaciona-se este fato a adaptação do parasita a diferentes ambientes durante a infecção de células de mamíferos, incluindo mudanças em fontes de energia, respostas de estresse oxidativo, controle do ciclo celular e componentes da superfície celular. É importante mencionar que o remodelamento de expressão gênica de CL-14 pode ser devido, pelo menos em parte, a uma expressão reduzida ou atrasada de genes que codificam proteínas de superfície que estão associadas à transição de amastigotas para tripomastigotas, um passo essencial na o estabelecimento da infecção no hospedeiro de mamífero, explicando a não infectividade da cepa (Bellew et al, 2017).
Vídeo 1 – Ciclo biológico do T. cruzi
Vídeo 2 – Ciclo biológico do T. cruzi. Vídeo histórico filmado por Dra. Hertha Meyer
Cultivo Celular
Técia Ulisses de Carvalho e Emile S. Barrias
Programa de Biofísica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
E-mail: tecia@biof.ufrj.br
O Trypanosoma cruzi infecta uma grande variedade de células nucleadas in vitro e in vivo, embora apresente tropismo por certos tipos celulares, como por exemplo células musculares e macrófagos. Estas diferenças de tropismo celular estão relacionadas à diversidade genética existente entre diferentes cepas de T. cruzi. (Andrade et al, 1999). Visto que um dos segmentos mais importantes do ciclo biológico do T. cruzi é o ciclo intracelular, o cultivo de células eucarióticas tem sido muito utilizado em pesquisas científicas na tentativa de compreender os mecanismos moleculares do processo de reconhecimento, sinalização e invasão (e/ou fagocitose) das formas tripomastigotas e amastigotas do T. cruzi. Grandes contribuições neste campo foram feitas, em pesquisas pioneiras no Brasil, pela Dra. Hertha Meyer no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Atulamente diversos tipos celulares vem sendo utilizados por grupos de pesquisa na tentativa de reproduzir o ciclo intracelular nos hospedeiros vertebrados. Dentre os tipos celulares mais utilizados temos: linhagens de celulas epiteliais, já que o primeiro contato do parasito se dá com células deste tipo; macrófagos (cultivo primário humano ou de murinos e de linhagens estabelecidas), visto que estas células são as primeiras células do sistema imune cujo parasito tem contato; e cardiomiócitos (cultivo primário ou linhagens estabelecidas), devido ao tropismo destes parasitos por estes tipos celulares no estabelecimento da infecção.
As células, de modo geral, são cultivadas em ambiente asséptico (estéril) em placas de Petri, garrafas ou lamínulas (estéreis) e colocadas para interagir com T. cruzi. O suporte de crescimento celular utilizado (garrafas, placas ou lamínulas) dependerá do tipo de experimento que será realizado. O cultivo de células será dado com a utilizaçao de meios de cultura específicos para o tipo celular utilizado suplementado com soro fetal bovino. Este conjunto (meio de cultivo e soro fetal bovino) é responsável pelo aporte de aminoácidos, vitaminas, sais minerais e fatores de crescimento essenciais para a manutenção e multiplicação celular. Após o cultivo celular (célula hospedeira) o processo de interação com formas infectivas de T. cruzi pode ser feito por períodos curtos (poucos minutos ou horas) para entender os processos iniciais de reconhecimento e invasão do parasito, ou períodos mais longos (dias) para os estudos do comportamento intracelular do parasito. Os tripomastigotas podem ser obtidos de cultivos celulares (tripomastigotas de cultura, onde células são previamente infectadas com tripomastigotas e o pool de parasitos é recolhido após o rompimento das células), por obtenção de tripomastigotas do sangue de animais previamente infectados (tripomastigotas sanguíneos) ou por processo conhecido como metaciclogênese (diferenciação de epimastigotas em tripomastigotas, que pode ser realizado em laboratório com a utilização de condições específicas). A manutenção das culturas é feita em estufas, a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2. Estas células recém infectadas ou infectadas por longos períodos podem ser analisadas de diferentes maneiras: (i) fixação com Bouin e coloração pelo corante de Giemsa; (ii) observação por vídeo microscopia das células vivas (usando microscopia de contraste de fase ou interferencial); (iii) por imunofluorescência; (iv) pelas microscopias eletrônica de varredura e/ou de transmissão. Usando cultura de células foi possível reproduzir in vitro o ciclo biológico do parasito. Neste, formas tripomastigotas interagem com a célula através de processo de entrada relativamente complexo, envolvendo diferentes receptores/ligantes nas duas células envolvidas. Após o reconhecimento celular, diferentes vias de sinalização são disparadas e culminam na internalização deste parasito pela célula hospedeira, formando uma estrutura conhecida como vacúolo parasitóforo (que abriga o parasito). A este vacúolo se funde organelas ácidas conhecidas como lisossomos. Estes são responsáveis não só por acidificar o vacúolo parasitóforo como também são responsáveis por doar mebrana para a formação do vacúolo. Neste ambiente ácido, as formas tripomastigotas secretam enzimas que vão atuar na membrana do fagolisossomo (ou vacúolo parasitóforo) fazendo pequenos poros, que vão resultar na degradação desta membrana. Durante este processo, a forma tripomastigota começa um processo de diferenciação para forma amastigota, sendo então liberado para o citoplasma da célula hospedeira, onde se multiplica diversas vezes (por divisão binária, assexuada). Quando o citoplasma da célula hospedeira fica cheio de formas amastigotas há o início da nova diferenciação, agora de forma amastigota para forma tripomastigota. A forma tripomastigota é muito móvel e secreta enzima que atuará na membrana plasmática da célula hospedeira. Estes dois fatores levam ao rompimento desta célula, liberando muitas formas tripomastigotas para o meio extracelular. Embora a forma tripomastigota seja reconhecida como a principal forma infectiva de T. cruzi, têm sido demonstrado (de modo crescente) que amastigotas também possuem capacidade de infectar células hospedeiras nucleadas. Assim diversos grupos têm utilizado o sistema de cultivo celular acima descrito para estudos de infecção com amastigotas. Para tal a infecção passa a ser feita com esta forma evolutiva, ao invés de utilizar tripomastigotas. De modo geral, também há o reconhecimento de amastigotas com as células hospedeiras, disparo de vias de sinalização, formação do vacúolo parasitóforo com fusão de lisossomos, degradação da membrana do vacúolo, muitiplicação intracelular e diferenciação em tripomastigotas antes do rompimento celular. Neste caso, a única etapa do ciclo celular que deixa de ocorrer é a diferenciação de tripomastigotas em amastigotas (que se faz desnecessária). Os amastigotas utilizados para infecção podem ser provenientes de amastigotas liberados durante o rompimento celular natural (já que nem todos os amastigotas terminam a diferenciação antes do rompimento celular), por rompimento celular antes da diferenciação em tripomastigotas (métodos experimentais mecânicos e/ou quimicos) ou por processo conhecido com amastigogênese.
Cultivo
Meio axênico
Wanderley de Souza e Juliana Vidal
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
E-mail: wsouza@biof.ufrj.br
A forma epimastigota do Trypanosoma cruzi pode ser facilmente cultivada em meio axênico. Tal fato permitiu a execução de diversos estudos que contribuíram para o melhor entendimento ultraestrutural, bioquímico e fisiológico desta forma evolutiva. Estudos recentes apontam no sentido de que podemos considerar dois tipos de epimastigotas. Um corresponde àqueles que vem sendo mantidos por muitas passagens em cultura. Um segundo tipo é o obtido diretamente de formas tripomastigotas e que se mostram infectivos. Posteriormente verificou-se que dependendo das condições de cultivo, certa proporção das formas epimastigotas transforma-se em tripomastigotas. Este fato também facilitou diversos estudos desta forma infectante.
Inicialmente o cultivo da forma epimastigota foi realizado em meios bifásicos, do tipo ágar-sangue com uma fase líquida contendo soro fetal bovino. O T. cruzi e outros tripanosomatídeos crescem muito bem neste tipo de meio, por este motivo, o meio bifásico é muitas vezes utilizado no isolamento de novas cepas e de novos tripanosomatídeos recém-isolados. Apesar disso, o meio bifásico é inadequado para estudos bioquímicos devido à presença de inúmeras macromoléculas, além disso, frequentemente os parasitos crescem nesses meios em forma agregada dificultando estudos quantitativos do crescimento celular.
O desenvolvimento de meios monofásicos, em que as formas epimastigotas crescem livremente, abriu possibilidades de estudos quantitativos, inclusive com o emprego de contadores eletrônicos para avaliação do crescimento celular. Este tipo de cultivo é adequado para o estudo do efeito de drogas no crescimento celular, no processo de transformação celular etc. Vários são os meios utilizados rotineiramente para o crescimento de formas epimastigotas do T. cruzi. Entre eles merecem destaque o meio LIT e o de Warren. O meio LIT (abreviação de “liver infusion tryptose”), o mais utilizado atualmente, foi idealizado inicialmente por Yager e popularizado por Camargo que realizou estudos básicos sobre o crescimento e diferenciação do T. cruzi. Significativos avanços ocorreram no cultivo de tripanosomatídeos não patogênicos, até o desenvolvimento de meios quimicamente definidos, o que é importante para o estudo de certas vias metabólicas, para o conhecimento das exigências nutricionais destes protozoários, dentre outros. Outro meio muito utilizado é o meio definido de Roitman. Este meio em geral contém glicose, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de purina e hemina. No caso dos tripanosomatídeos digenéticos várias tentativas foram feitas no sentido de simplificar o meio, eliminando macromoléculas, tendo se chegado a um meio desenvolvido por Cross e Manning que permitiu o crescimento do T. brucei. Posteriormente vários autores utilizaram com sucesso este meio, com pequenas variações, para o cultivo do T. cruzi. No entanto, o crescimento é relativamente pequeno o que limitou a sua utilização. Certamente novos estudos são necessários nesta área.
Desde os primeiros cultivos usando meios bifásicos, como o NNN (Neal, Novy, Nicolle), verificou-se que formas tripomastigotas apareciam na fase estacionária do cultivo e que a sua percentagem aumentava com o envelhecimento da cultura. Para estes tripomastigotas foi também dada a denominação de tripomastigotas metacíclicos, pois, são oriundos da transformação a partir de formas epimastigotas em meios que mimetizam o ambiente encontrado no interior do trato digestivo do inseto vetor. Ao processo de transformação denominou-se metaciclogênese. Camargo foi o primeiro a analisar sistematicamente o processo de transformação de epimastigotas em tripomastigotas usando o meio LIT. Foi mostrado que após o quarto dia de cultivo a cultura atinge a fase estacionária, a partir do qual inicia o processo de transformação.
A metaciclogênese pode ser mimetizada, através do estímulo de alguns fatores envolvidos no processo de diferenciação. Os mais bem definidos são a exaustão ou a falta de certos nutrientes e o pH. O metabolismo de T.cruzi é organizado com base no rápido consumo de glicose, mas a glicose não é completamente metabolizada neste processo. Em consequência à exaustão de carboidratos, os parasitas preenchem suas necessidades energéticas com o consumo de aminoácidos. Baseado nisso, o protocolo mais utilizado para realizar metaciclogênese in vitro de para o T. cruzi, é aquele desenvolvido por Samuel Goldenberg e colaboradores. Tal protocolo que utiliza o clone Dm28c mantido como epimastigota no meio LIT e então transferido para um meio pobre, que reproduz parcialmente a composição da urina do triatomíneo e que foi denominado meio TAU (Triatomine Artificial Urine). Quando este sistema é utilizado observa-se inicialmente uma adesão das formas epimastigotas ao substrato e posteriormente o seu desligamento e transformação nas formas tripomastigotas, mimetizando o que acontece no hospedeiro invertebrado. Índices de metaciclogênese de 90% têm sido descritos com este meio, porém, somente para o clone Dm28c. No entanto, para que se mantenham índices razoáveis de metaciclogênese é necessário que periodicamente a cepa seja “reciclada” por passagem no inseto vetor. Por outro lado, este sistema não oferece resultados satisfatórios para outras cepas do T. cruzi.
O processo de metaciclogênese envolve alterações morfológicas, genéticas e metabólicas no parasito, além disso, promovem alterações em estruturas celulares, como no arranjo de DNA do cinetoplasto e no formato nuclear (Figura 1). Muitas vezes as mudanças fisiológicas, como por exemplo a infectividade, precede a completa transformação morfológica. Surge consequentemente, o que podemos considerar como formas intermediárias que muitas vezes já apresentam características típicas da forma tripomastigota. Algumas modificações que ocorrem ao nível de superfície podem ser utilizadas para a separação das formas epimastigotas e tripomastigotas. Formas epimastigotas são lisadas pelo sistema complemento (em geral usa-se soro fresco de cobaia) enquanto que os tripomastigotas são resistentes. As formas intactas, tripomastigotas, podem ser facilmente separadas dos restos celulares das formas lisadas por centrifugação em gradiente. Uma outra propriedade que muda durante a transformação epimastigota-tripomastigota é a carga de superfície, o que permite a separação destas duas formas com a utilização de troca iônica com as colunas de DEAE celulose. Atualmente é também possível reverter o processo de metaciclogênese inoculando-se formas tripomastigotas obtidas como descrito acima em meio LIT. Usando esta metodologia, um estudo recente mostrou que as formas epimastigotas recém diferenciadas (provenientes de tripomastigotas de cultura ou tripomastigotas metacíclicos) são capazes de infectar células de mamífero in vitro.
Figura 1: Transformação epimastigota-tripomastigota observada por microscópio eletrônico de transmissão.
A forma amastigota do T. cruzi também pode ser obtida em cultivo axênico. Desde as primeiras observações do T. cruzi em cultura verificou-se que a incubação de tripomastigotas sanguíneos em cultura à temperatura ambiente levava a formação de formas arredondadas. Muitas vezes, como mostrado por Brener e Chiari, formam-se massas de formas arredondadas de difícil dissociação. Posteriormente Pan desenvolveu alguns meios em que amastigotas podiam ser cultivados a 35,5ºC. Rondinelli e colaboradores mostraram, utilizando a cepa CL, que quando epimastigotas crescendo no meio LIT tradicional são transferidos para um meio ligeiramente modificado, chamado por Chiari de M16, transformam-se em tripomastigotas. Tratamento desta população com soro humano fresco e posterior transferência para o meio LIT dá origem a agregados de formas arredondadas, com características de formas amastigotas ou esferomastigotas. Estas formas são resistentes à lise por complemento. Quando estas formas são mantidas em meio contendo alta concentração de soro (55%) a 37ºC surgem formas tripomastigotas, parecidas morfologicamente com as formas sanguíneas. Se as culturas forem envelhecidas ou mantidas à mesma temperatura, mas na presença de baixa concentração de soro (10%), formas epimastigotas são observadas. Este sistema permite a obtenção de número significante das três formas evolutivas (108 células/ml) para estudos bioquímicos.
O cultivo axênico das formas epimastigotas, assim como os meios que possibilitam a diferenciação para tripomastigotas e amastigotas possibilitaram e continuam possibilitando diversos estudos que adicionam informações relevantes sobre a biologia celular deste protozoário parasito humano. Tais dados contribuirão para desvendar mecanismos essenciais para a biologia deste protozoário e poderão dar suporte a pesquisas que objetivam a elaboração de estratégias para intervenções terapêuticas eficientes contra o T. cruzi.